استخراج پلاسمید با بافر قلیلیی

اولین بار لیز قلیایی به وسیله Birnboim  و دالی در سال ۱۹۷۹ مطرح شد (Nucleic Acids Res. 7, 1513-1523) و با کمی تغییرات اکنون سالهاست که به عنوان روشی مناسب برای استخراج  پلاسمید استفاده می شود. راحت ترین راه برای توضیح اینکه لیز قلیایی چگونه انجام می شود این است که نگاهی به فرآیند آن بیاندازیم، پس ببینیم..

 

پلاسمید

 

  • رشد سلولی و برداشت آن

این فرآیند با رشد دادن سلول های باکتری در محیط کشت انجام می شود، باکتریهایی که حاوی پلاسمید مورد نظر هستند. هنگامی که سلول ها به رشد کافی رسیدند، برای خارج کردن آنها از محیط کشت پلت گیری انجام می شود یعنی به وسیله سانتریفیوژ رسوب داده و از محیط خارج می شوند.

  • معلق سازی ( re-suspension) در استخراج پلاسمید

پلت مجددا در محلولی معلق می شود (معمولا محلول ۱ یا مشابه آن) نامیده می شود. این محلول دارای Tris، EDTA، گلوکز و RNase A میباشد.

کاتیون های دو ظرفیتی (Mg2+، Ca2+) برای فعالیت DNase و تمامیت دیواره سلولی باکتری ضروری است. EDTA کاتیون های دو ظرفیتی را شلاته می کند و درنتیجه از آسیب رساندن DNase به پلاسمید جلوگیری می کند. بعلاوه، باعث ناپایداری دیواره سلولی می شود. گلوکز فشار اسمزی را ثابت نگه می دارد و بنابراین سلول ها متلاشی نمی شوند. RNase A نیز برای خرد کردن RNA سلولی در موقع لیز به کار می رود.

  • لیز سلولی در استخراج پلاسمید

بافر لیز ( محلول ۲) دارای هیدروکسید سدیم (NaOH) و سدیم دو دسیل سولفات (SDS) است.  SDS در اینجا به کار می رود چون غشای سلولی را محلول می سازد و اکثر پروتئین های سلولی را دناتوره می کند که این کار بعدا در جدا کردن پروتئین ها و پلازمد کمک می کند.

NaOH به شکستن دیواره سلولی کمک می کند، و از طرفی از تشکیل پیوند هیدروژنی جفت بازهای DNA جلوگیری می کند. لذا، دو رشته DNA ژنومیک و پلازمید را به تک رشته ای تیدیل می کند. اسم این عمل دناتوره کردن نام دارد و قسمت میانی فرایند است.

بسیار مهم است که در طول این مرحله محلول معق شده و بافرهای لیز به خوبی ترکیب شوند البته نه خیلی به شدت. همچنین، به خاطر داشته باشید SDS و NaOH مضر هستند و پیشنهاد می شود حتما در هنگام کار با بافر قلیایی دستکش و محافظ چشم داشته باشید.

  • خنثی سازی (Neutralization) در استخراج پلاسمید

اضافه کردن پتاسیوم استات (محلول ۳) منجر به کاهش مدرجه قلیایی محلول میشود. در این شرایط باندهای هیدروژنی بین بازهای تک رشته های DNA آماده شده و مجددا دورشته های DNA تشکیل می شود. هرچقدر که تشکیل دورشته حلقوی پلازمید راحت است، تشکیل دو رشته DNA ژنومی دشوار است و تقریبا دو رشته شدن کامل آن ممکن نیست. به این علت است که گفته می شود در حین فرآیند محلول ها را خیلی به شدت تکان ندهید زیرا این کار منجر به تشکیل رشته های کوتاه جدا شده می شود که مستعد تشکیل پیوند با تک رشته ای های پلاسمید هستند.

پلاسمید دو رشته ای به راحتی از محلول قابل دریافت است. DNA ژنومی تک رشته ای، SDS و پروتئین های دناتوره شده از طریق پیوندهای هیدروفوبیک به هم متصل می شوند و یک رسوب سفید رنگ را تشکیل می دهند. این رسوب به راحتی به وسیله سانتریفیوژ از پلاسمید جدا می شود.

  • پاکسازی و تغلیظ در استخراج پلاسمید

اکنون DNA پلاسمید شما از قسمت اعظم باقی مانده های سلولی جدا شده است اما هنوز محلول ها حاوی مقدار زیادی نمک  EDTA، RNase و اجزاء ریزتر پروتئینی و سلولی هستند لذا به هنوز کاملا مناسب کارهای بعدی نیستند. بنابراین قدم بعدی پاکسازی محلول و تغلیظ DNA پلاسمید است.

برای این کار راه های بسیاری وجود دارد که از جمله آن می توان به فنول –کلروفرم و بعد رسوب دهی با اتانول یا استفاده از ستون های کروماتوگرافی تمایلی که در شرایط نمکی و pH خاص به DNA پلاسمید متصل می شوند و در یک شرایط خاص دیگر آن را رها می کنند. رایج ترین روش ها را می توانید در مقاله ۵  روش معمول برای تخلیص  DNA مطالعه نمایید.

منبع : The basics: How alkaline lysis works

 

اگر این مقاله مفید بود آن را به دوستانتان پیشنهاد کنید.