۵ روش معمول برای تخلیص DNA

 

یکی از رایج ترین اموری که در زیست شناسی مولکولی انجام می شود تخلیص DNA است. ما DNA را از محلول های آبی تخلیص می کنیم تا بتوانیم آن را از نمک های بافر، آنزیم ها یا دیگر مواد موجود که بر روی فرایندهای بعدی تاثیر می گذارند جدا کنیم. از کاربردهای این روشها می توان به خالص سازی واکنش PCR ، خالص سازی بعد از برش آنزیمی با آنزیم های محدودالاثر و خالص سازی DNA ژنومی یا پلازمید از پروتئین ها و مواد زائد سلولی اشاره نمود.

به صورت معمول ۵ روش برای این کار وجود دارد که در این مقاله به آنها اشاره می کنیم.

۱- تخلیص DNA به وسیله فنول کلروفرم

استخراج به وسیله فنول –کلروفرم (این مقاله را بخوانید Kirby, ۱۹۵۷) معمولا بعد از فرآیند ته نشین سازی از طریق اتانول انجام می شود و یک راه سنتی برای حذف پروتئین های نمونه DNA می باشد. در این فرآیند، محلول DNA با کلروفرم و فنول ترکیب می شود. DNA محلول در آب در فاز آبی جدا می شود و پروتئین ها در فاز آلی حلال دناتوره می شوند و در آن می مانند. فاز آلی دارای پروتئین های عاری از DNA است که بعدا می توان آنها را جمع آوری نمود.

مزایا: راه ساده و ارزان برای جداسازی پروتئین ها از محلول های DNA

معایب: نسبت به روش های جدید زمان بیشتری نیاز دارد. امکان ماندن کلوروفرم و فنل در نمونه نهایی وجود دارد (می تواند واکنش های آنزیمی بعدی را تحت تاثیر قرار دهد). کلروفم و فنول هردو برای سلامت انسان مضر هستند.

 

۲- تخلیص DNA به روش ته نشین سازی بوسیله اتانول

ته نشین سازی بوسیله اتانول روشی رایج برای نمک زدایی و تغلیظ DNA می باشد. کاتیون های تک ظرفیتی ( به میزان ۰.۱  الی ۰.۵ مولار معمولا به صورت نمک استات سدیم مصرف می شوند) همراه با اتانول ۷۰% به DNA اضافه می شود.

اتانول ساختار DNA را تغییر می دهد و بنابراین باعث می شود تا مولکول DNA تجمع پیدا کند و در محلول ته نشین شود. (  Eickbush and Moudrianakis, ۱۹۷۸را ببینید). اکثر نمک ها و مولکول های آلی کوچک در اتانول ۷۰% محلول هستند. DNA را می توان بوسیله سانتریفیوژ جداسازی کرد.

مزایا: روشی آسان و ارزان برای نمک زدایی DNA

معایب: زمانگیر می باشد، ریسک وجود اتانول در نمونه نهایی وجود دارد

 

۳- تخلیص DNA با کمک کیت های ستونی

این کیت ها یک روش رایج برای تخلیص DNA هستند. اساس کار آنها هم به این شکل است که نمک های کاتروپیک جهت دناتوره کردن DNA (بوسیله باز کردن پیوندهای هیدروژنی) به نمونه اضافه می شود. در این شرایط DNA می تواند به صورت انتخابی به رزین های سیلیکای موجود در ستون اضافه شود. این کار جداسازی آن را از دیگر اجزاء موجود در نمونه راحت تر می سازد. پس از شستشو، DNA بوسیله محلول الوت با میزان نمک پایین جمع آوری می شود. محلول الوت به نوسازی (renaturing) DNA کمک می کند و باعث جداسازی آن از سیلیکا می شود. اکثر کیت های تجاری بر این اساس کار می کنند. طیف وسیعی از کیت های تخلیص بعد از استخراج از ژل آگاروز، واکنش های آنزیمی و PCR استفاده می شوند.

مزایا: به طور معمول استفاده می شود، سریع است، کاربر تعداد زیادی نمونه را می تواند با گزینه خلاء انجام دهد

معایب: ممکن است هزینه بر باشد. برخی از کیت ها بازده پایینی دارند (کمتر از ۲۵%). استفاده از نمک های کاتروپیک می تواند مشکل ساز باشد.

نکته: برخی از عرضه کنندگان این کیتها کیتهای پیشرفته تری را ارائه می دهند که با استفاده از آنها در میزان کم الوت می توان DNA با غلظت بالاتری داشت.

 

۴- تخلیص بوسیله تبادل آنیون (anion exchange)

روشهای خالص سازی مبتنی بر تبادل آنیونی DNA معمولا از رزینهای DEDE دارای بار مثبت استفاده می کنند که به فسفات DNA که دارای  بار منفی است متصل می شوند. با استفاده از نمک های خاص و شرایط مختلف  pH مولکول DNA به رزین متصل می شود و با یک مرحله شستشوی سخت آلودگی ها (پروتئینها و باقی مانده های سلولی) از محیط خارج می شوند. نهایتا DNA باقی مانده را می توان به صورت انتخابی از رزین الوت نمود.

مزایا: DNA با خلوص بالا که مناسب فرایند های پایین دست (Downstream) مانند سکانس DNA و ترنسفکشن

معایب: رزین ها گران قیمت هستند

 

۵- تخلیص با کمک دانه های مغناطیسی (Magnetic beads)

در این مورد رشته های DNA با کنترل pH به دانه های مغناطیسی متصل می شوند. تعداد کمی کیت با تکنیک دانه های مغناطیسی در دنیا تولید می شود. دانه های مغناطیسی دارای بار مثبت هستند و در pH پایین به DNA متصل می شوند، اما در pH بالا دارای بار منفی می شوند و DNA را رها می کنند.

مزایا: سریع ، عدم استفاده از نمک های کاتروپیک و محلول های آلی شستشو. گزینه مناسب برای فرآیندهای اتوماتیک با توان بالا به این دلیل که دیگر نیازی به انجام سانتریفیوژ و دیگر مراحل وقت گیر نیست.

نکته اینکه دانه های مغناطیسی دیگری نیز وجود دارند که بر اساس غلظت نمک به DNA متصل می شوند.

معایب: قیمت خرید اولیه این کیت ها بالا می باشد. زمانی این فرایند مشکل دار می شود که شما آن را برای نمونه های گوناگون استفاده کنید، البته این موضوع در استفاده از دستگاه های اتوماتیک دیده نمی شود.

منبع: Bitesizebio