۸ نکته ضروری در الکتروفورز DNA

انتخاب محصولات و روش های مناسب جهت انجام الکتروفورز برای آنالیز اسید نوکلئیک در موفقیت آزمایش ضروری است. این نکات به بهبود نتایج الکتروفورز و آنالیز رایج DNA و RNA بسیار کمک می کند. در این مقاله می خواهیم نکات جالب و مهمی را ارائه دهیم. امیداریم که این نکات برای شما مفید باشد.

 

نکته ۱: انتخاب لدر مناسب برای مشخص کردن محصولات PCR یا ژل های با بازده بالا

لدرهای مناسب آنهایی هستند که دارای باندهای کمتری هستند. لدرهایی را انتخاب کنید که باندها در آنها سریع جدا می شوند و حرکت سریعتری دارند.

نکته ۲: انتخاب غلظت بهینه ژل آگارز

غلظت آگارز تاثیر بسزایی بر روی کیفیت جداسازی نمونه ها یا لدر بر روی ژل دارد. هرچه طول DNA  بلندتر باشد به آگارزی با غلظت پایینتر احتیاج است.

جدول ذیل را مشاهده نمایید

جدول: غلظت آگارز بر کیفیت جداسازی تاثیر می گذارد

غلظت آگارز ( %) بازه طولی جداسازی کامل
۰.۵ ۲۰۰۰ الی ۵۰۰۰۰ جفت باز
۰.۶ ۱۰۰۰ الی ۲۰۰۰۰ جفت باز
۰.۷ ۸۰۰ الی ۱۲۰۰۰ جفت باز
۰.۸ ۸۰۰ الی ۱۰۰۰۰ جفت باز
۰.۹ ۶۰۰ الی ۱۰۰۰۰ جفت باز
۱ ۴۰۰ الی ۸۰۰۰ جفت باز
۱.۲ ۳۰۰ الی ۷۰۰۰ جفت باز
۱.۵ ۲۰۰ الی ۳۰۰۰ جفت باز
۲ ۱۰۰ الی ۲۰۰۰ جفت باز
۳ ۲۵ الی ۱۰۰۰ جفت باز
۴ ۱۰ الی ۵۰۰ جفت باز
۵ ۱۰ الی ۳۰۰ جفت باز

 

شکل ۲: A) غلظت آگارز می تواند بر شقاقیت لدر های DNA تاثیر بذارد. B) شفافیت باندها در زمانی که غلظت آگارز به خوبی بر اساس سایز قطعات DNA انتخاب شده باشد بهبود میابد.

 

نکته ۳: از TBE استفاده کنیم یا TAE؟

 

TAE

  • معمولا برای قطعات بلند استفاده می گردد
  • با واکنش های آنزیمی سازگاری دارد
  • برای درست کردن ژل الکتروفورز پیشنهاد می شود

 

TBE

به صورت معمول برای جداسازی قطعات کوچک DNA استفاده می شود.

 

شکل ۳: انتخاب رانینگ  بافر (بافر الکتروفورز) مناسب. قطعات نوکلئیک اسید به میزان ۱۰ درصد کندتر در بافر TBE حرکت می کنند.

 

برای آشنایی با افزودنی های PCR روی تصویر کلیک کنید

pcr

نکته ۴: انتخاب بافر بارگذاری مناسب برای نمونه

بافر بارگذاری (Loading buffer) نمونه برای ۲ هدف استفاده می شود:

  • رنگ مرئی را فراهم می کند که کاربر می تواند به کمک آن نمونه را در هنگام بارگذاری در چاهک ها ببیند همچنین نشان می دهد که چه میزان ژل ران شده است.
  • این بافر دارای غلظت بالایی از گلیسرول یا سوکروز می باشد که باعث سنگین شدن نمونه شده و کمک می کند که نمونه در انتهای چاهک ها قرار بگیرند و در بافر الکتروفورز پخش نشوند.

هنگامی که می خواهید از بافر رانینگ استفاده کنید مطمئن شوید که از یک بافر هم برای نمونه و هم برای لدر استفاده می کنید. از پوشاندن باند های خود بوسیله رنگ های موجود در بافر بارگذاری جلوگیری نمایید. برای مثال، بافر ۶X لودینگ DNA دارای رنگ Orange G است ( مشابه DNA با طول ۵۰bp حرکت می کند) و Xylene cyanol ( مشابه DNA با طول ۴۰۰۰ bp حرکت می کند) . بنابراین زمانی که این بافر بارگذاری مناسب قطعات کوچک است باندهایی با طول تقریبا ۵۰bp ممکن است بوسیله رنگ Orang G پوشانده شده و نشان داده نشوند.

 

شکل ۴: انتخاب بهترین بافر لودینگ برای الکتروفورز ژل

 

نکته ۵: انتخاب نمونه های گزینشی برای الکتروفورز

  • بارگذاری مقدار زیاد DNA می تواند بر روی حرکت نمونه بر روی ژل تاثیرگذار باشد. حجم زیاد قطعات DNA بر روی ژل به آهستگی حرکت می کند و در نتیجه از چیزی که به واقع است بزرگتر نشان داده می شود.
  • DNA های بسیار کوچک به سختی بر روی ژل تشخیص داده می شوند. مشخصا باندهای های کوچکتر بیرنگ تر هستند.

مطمئن شوید که میزان DNA بارگذاری شده بر روی ژل حداقل ۲۰ng به ازای هر باند باشد. این در صورتی است که ژل را به وسیله اتیدیوم بروماید (EtBr) یا سایبر سیف (SYBR Safe) رنگ می کنید. سایبر گلد بسیار حساستر از این دو رنگ است و اگر از آن استفاده می کنید DNA در هر چاهک باید حد اقل ۱ng به ازای هر باند باشد.

 

شکل ۵: تاثیر غلظت نمونه بر الگوی حرکت

 

 

نکته ۶: انتخاب اندازه ژل بهینه

 

  • برای ژل های کوچک : ژل های ۸ در ۱۰ سانتیمتر (مینی ژل) به صورت معمول استفاده می شود. حجم آگارز برای مینی ژل ها معمولا ۳۰ الی ۵۰ میلی لیتر است.
  • برای ژل های بزرگ : این ژل ها معمولا برای ساترن و نورترن بلات استفاده می شوند. حجم محلول آگارز برای این ژل ها باید به اندازه ۲۵۰ میلی لیتر باشد.

 

نکته ۷: جلوگیری از اثر “لبخند”

دلایل اصلی اثر لبخند شامل موارد ذیل هستند:

  • حرارت دادن ناجور ژل در نقاط مختلف. این موضوع زمانی پیش می آید که ولتاژ بالا باشد. برای جلوگیری از این قضیه کاربر می تواند ژل را آهسته ران کند (ولتاژ را کم کند). بعد از این کار دما نیز درون تانک کاهش پیدا می کند.
  • توزیع ناجور میدان الکتریکی در عرض ژل. این موضوع می تواند با چک کردن تنظیمات تانک برای اتصالات ضعیف یا دیگر مشکلات ساختاری دستگاه باشد.

 

شکل ۶: اثر ” لبخند” را نشان می دهد

 

نکته ۸: اهمیت غوطه ور سازی ژل درون بافر الکتروفورز (Running buffer)

یک ژل باید به صورت کامل درون بافر الکتروفورز غوطه ور شده باشد و به اندازه ۳ الی ۵ میلیمتر بالای ژل را بافر بپوشاند.

بافر ناکافی می تواند منجر به شفافیت پایین ژل ها، خراب شدن باند و حتی ذوب شدگی ژل شود. بالا بودن میزان بافر هم می تواند منجر به کاهش حرکت DNA و خراب شدن باند گردد.

 

شکل۷: حجم بافر الکتروفورز می تواند بر روی حرکت DNA و شفافیت باندها تاثیرگذار باشد

 

به پایان مقاله ۸ نکته ضروری در الکتروفورز DNA می رسیم، ممنون که با ما همراه بودید، این مقاله از جمله مفیدترین مقالاتی است که در مورد الکتروفورز ژل آگاروز و لدر DNA نوشته شده است. برای مشاهده اصل مقاله به زبان انگلیسی می توانید اینجا کلیک کنید.