مهار کننده های PCR

 

معمولا، برای شما هم پیش آمده که هر کاری را برای یک PCR انجام داده باشید ولی با اینکه به بهترین شکل DNA خود را استخراج کرده اید، از تیوب ها و سرسمپلرهای استریل و مواد تمیز استفاده کرده اید، اما یک چیز نا معلومی نتایج PCR شما را خراب کرده باشد. این موارد نا معلوم مهار کننده های PCR (PCR inhibitors) هستند.

قبل از اینکه این موضوع را به قانون مورفی مربوط کنید آزمایش خود را مجدد انجام دهید. اجازه بدهید مشخص شود که مهارکننده های PCR چرا اینقدر اذیت می کنند و ما چه کاری می توانیم برای جلوگیری از آنها انجام بدیم.

مهار کننده های PCR چه هستند؟

مهار کننده های PCR از تکثیر نوکلئیک اسیدها جلوگیری می کنند ومنجر به ایجاد جوابهای اشتباه، کاهش حساسیت یا از بین رفتن PCR می شوند. مهار کننده ها به نوکلیئک اسیدها و پلیمرازها متصل می شوند و در همانندسازی DNA  اختلال ایجاد می کنند یا به کوفاکتورهای اصلی مانند Mg متصل شده و از دسترسی آنزیمها به آنها جلوگیری می کنند.  مهار کننده ها حتی می توانند اتصال پرایمرها به DNA را مختل کنند.

مهار کننده های PCR از کجا می آیند؟

مهار کننده ها در نمونه ها : بافت (برای مثال کلاژن)، خون ( برای مثال هپارین، هموگلوبین، ایمونوگلوبولین ها، پروتئازها، نوکلئازها)، مدفوع (نمک هایی صفرا، اوره) ، محیط کشت سلولی و در مواد گیاهی( برای مثال: کلوروفیل).نها جلوگیری می کنند. حییی

مهار کننده ها در آماده سازی نمونه: مواد شیمیایی موجود در فرایند استخراج و آماده سازی نمونه شامل: (برای مثال: KCl، NaCl، دترجنت هایی مانند SDS،  Triton X100، Tween20، Xylene) ، نوکلئازهایی با منشاء خودتان

مهار کننده ها در خالص سازی نوکلئیک اسیدها: مواد خاصی که برای خالص سازی استفاده می شود اگر در ادامه واکنش حذف نشود و یا در غلظت خاصی باقی بماند می تواند برای PCR مهار کننده باشد (برای مثال: اتانول، ایزوپروپانول، فنول و سدیم استات).

در هنگام خالص سازی این مواد جا می مانند و با نوکلئیک اسید خالص سازی می شوند. EDTA در بافر TE، که به طور معمول برای نگهداری DNA استفاده می شود می تواند با به دام انداختم یون های Mg منجر به مهار PCR شود.

مهار کننده ها در مصرفی های آلوده: پودر موجود بر روی دستکش ها، نوکلئاز های موجود در تیوب ها و نوک سمپلرها

حقیقت خنده دار: امونوگلوبولین های طبیعی (IgG) موجود در خون یکی از قویترین مهارکننده های PCR هستند زیرا تمایل شدیدی به اتصال به مولکول DNA تک رشته ای دارند. این خاصیت مهار کنندگی را می توان با انکوبه کردن نمونه با DNA های غیر اختصاصی خنثی نمود تا IgG غیر فعال شود.

 

 

چطور می توان مهار کننده های PCR را تشخیص داد؟

برای یافتن مشکل، در هر مرحله از فرآیند و خالص سازی کنترل قرار دهید تا مشخص شود کدام مرحله آلودگی به مهار کننده دارد و PCR را دچار اختلال می کند. همچنین قسمت کوچکی از نمونه های خود را در هر مرحله نگه دارید. این موضوع به شما کمک می کند که در صورت نیاز به مرحله قبل برگردید و مشخص کنید که ایراد از کجا بوده است.

  • کنترل مثبت های داخلی (تیوب های مشابه) را با کنترل مثبت های خارجی (تیوب های متفاوت) مقایسه کنید . تکثیر را بین نمونه تست و واکنش های کنترل که به صورت موازی انجام شده اند مقایسه کنید. این کنترل های مثبت، کنترل های عالی برای هر متغیر در واکنش PCR هستند که می تواند شامل خود تیوب که با تیوب کنترل مشابه است شود.
  • می توانید از اسپکتروفتومتری برای بررسی حضور مهارکننده ها استفاده کنید. جذب A260/280 نزدیک به ۲ مربوط به RNA و ۱.۸ مربوط به DNA می باشد. ( اندازه پایینتر نشان دهنده وجود آلودگی فنول یا پروتئین می باشد). جذب A260/230 برای RNA باید نزدیک به ۲.۲ باشد و برای DNA باید ۲ باشد (اندازه کمتر به معنی کربوهیدرات، گوانیدین، فنول یا آلودگی گلیکوژن است).
  • در موارد بسیار حساس و نامعلوم می توانید از آنالیزهای HPLC یا MS استفاده کنید

چه کاری انجام دهم تا از مهار کننده های PCR جلوگیری کنم؟

  • در شرایط تمیز کارکنید، از نوک سمپلرهای تمیز و تیوب های تمیز استفاده کنید.
  • از پوشش های محافط مانند دستکش، روپوش و ماسک استفاده کنید تا آلودگی نوکلئازی کاربر پیدا نشود.
  • از روش های استاندارد برای تهیه نمونه استفاده کنید ، اگر در روشی که استفاده می کنید نمونه ها تمیز نیستند روشتان را تغییر دهید.
  • از روشهای کامل برای خالص سازی استفاده کنید (برای مثال روش استخراج با گوانیدیوم ایزوتیوسیانات برای یک سری نمونه ها بهتر جواب می دهد، روش استخراج با فنول کلوروفرم برای نمونه هایی که آلودگی لیپیدی دارند بهتر پاسخگو است. دقت کنید از فنل زیاد استفاده نشود زیرا فنول خودش مهارکننده ی PCR است)
  • از کربن فعال، ستون های سیلیکا، رزین های تبادلی کاتیونی، دانه های سیلیکای مغناطیسی یا روش های گرفتن ایمونولوژیک (Immunocapture) جهت حذف آنتی ژن های مهارکننده استفاده کنید. در پزشکی قانونی که آلودگی نمونه ها همیشه یک مساله است از چلکس (chelex) برای خالص سازی DNA استفاده می شود.
  • از کیت های تجاری استفاده کنید که می توانند مهارکننده ها را از محیط خارج کنند.
  • از آنزیم تک پلیمراز نوترکیب استفاده کنید که قدرت بالاتری دارد و به مهارکننده ها مقاومت بیشتری دارد.
  • DNA را به جای TE در آب نگهداری کنید. برای جلوگیری از خرد شدن DNA آن را در حجم های کوچک الیکوت (تقسیم) کنید.
  • از افزودنی ها یا تسهیل کننده ها استفاده کنید (برای مثال، بتائین، BSA، DMSO، فرمامید، گلیسرول، PEG، پودر شیر، مهارکننده های پروتئاز، مهارکننده های نوکلئاز). انتخاب افزودنی ها به نمونه ای که می خواهید مهار شود بستگی دارد.
  • PCR خود را به اندازه های کوچکتر الیکوت کنید تا غلظت مهارکننده کم شود. البته این کار می تواند باعث کاهش حساسیت PCR شود و تشخیص نمونه هدف مشکلتر می شود.

مهار کردن مهارکننده های خاص:

حذف فنول: از polyvinylpyrrolidone استفاده کنید

حذف پلی ساکاریدها: از  Tween-20, DMSO, PEGو کربن فعال استفاده کنید

حذف هیومیک اسید (در نمونه های ادرار بسیار دیده می شوند): دیالز، فلوکولاسیون، روشهایی که بر اساس ستون هستند، اولترافیلتراسیون

حذف پروتئاز ها: مهار کننده  های پروتئاز، BSA

حذف Ca۲+ : افزودن Mg۲+ یا دیگر عوامل چلاه کننده

این مقاله یک بررسی اجمالیست در خصوص مهارکننده های PCR و راه های مقابله با آنها. اگر شما هم از جمله افرادی هستید که با یک PCR مهارشده مواجه هستید، بر روی PCR خود یک آنالیز انجام دهید تا بتوانید مهارکننده PCR خود و تاثیر آن را پیدا کنید. بعد از آن روش مقابله با آن را بررسی کنید. در این مقاله ما تعدادی از مهار کننده ها را خدمتتان معرفی کرده ایم و در زیر نیز چند رفرنس برای اطلاعات بیشتر قرار می دهیم، امیدواریم که برای کار شما مفید باشد.

برای مطالعه بیشتر:

  1. Thermo Scientific technical bulletin T123 Rev 1/2012 https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/T123-NanoDrop-Lite-Interpretation-of-Nucleic-Acid-260-280-Ratios.pdf accessed 2017-05-28.
  2. Schrader C et al. (2012) PCR inhibitors – occurrence, properties, and removal. J Appl Microbiol ۱۱۳(۵):۱۰۱۴-۲۶.
  3. Abu Al-Soud W et al. (2000) Effects of amplification facilitators on diagnostic PCR in the presence of blood, feces, and meat. J Clin Microbiol ۳۸(۱۲):۴۴۶۳-۷۰.
  4. van Pelt-Verkuil et al, Principles and technical aspects of PCR amplification. Springer 2008, ISBN 978-1-4020-6240-7
  5. www.bitesizebio.com