عیب یابی استخراج RNA

 

استخراج RNA یکی از پرکاربردترین روشها می باشد ولی بسیار ریزه کاری دارد. هر کسی که این کار را انجام داده است معمولا نکات و روش خودش را دارد که استخراج RNA را بدون نقص انجام دهد و یک RNA خوب داشته باشد. اگرچه RNA غیر قابل پیش بینی است آن هم به دلیل ناپایدار بودنش، ولی، مشکلات رایجی وجود دارد که قابل حل هستند.

 

مساله: وجود DNA ژنومی در RNA

RNA با DNA ژنومی الوت (Elute) می شود که نشانه آن وجود اسمیر با وزن بالا است. یا اینکه چیزی روی ژل دیده نمی شود ولی کنترل های منفی RT  موقع PCR تکثیر دارند.

علت:

مهم نیست چه روشی را برای استخراج RNA استفاده کرده اید، همیشه ردی از DNA می بینید. این موضوع در استفاده از ترایزول (فنول) و ستون های اسپین (Spin column) وجود دارد. علت آن می تواند به این دلیل باشد که در هنگام هوموژنیزاسیون، DNA به خوبی خرد نشده است. اگر از روش فنول استفاده می کنید، pH فنول یک نکته مهم است (باید اسیدی باشد) و شما باید مهارت این را داشته باشید که فقط فاز آبی را بکشید تا آلودگی DNA کمتری داشته باشید.

 

spin column RNA isolation

 

راه حل:

DNA ژنومی باید به خوبی هوموژن شود، باید از روشهایی استفاده شود که کامل DNA را بشکنند مانند high velocity bead beater و polytron rotor stator. در هنگام هوموژنیزاسیون نمونه ها گرم می شوند اما سرد کردن نمونه ها در گوانیدین باعث رسوب نمک می شود. بنابراین شما نیاز به تنظیم زمان هوموژنیزاسیون و زمان سرد کردن به اندازه دمای اتاق دارید.

 

high velocity bead beater

polytron rotor stater

 

بهترین راه برای حذف DNA ژنومی، تیمار با DNase است. برخی از کیتهای تجاری دارای DNase فعال و مقاوم به دما هستند که می توانند به طور کارآمدی آلودگی DNA  را حذف کنند. پس از حذف DNA، از یک رزین برای حذف DNase بدون گرما یا EDTA استفاده می شود. این نوع کیتها برای نمونه هایی که دارای مقدار زیادی DNA هستند (مانند بافت طحال)، برای نمونه هایی که با DNase خالص شده اند و زمانی که تیمار قسمتی از نمونه مورد نظر است استفاده می شوند. روش های برپایه ستون نیز می توانند برای نمونه هایی که دارای میزان کم DNA ژنومی هستند استفاده شوند.

 

نحوه هموژنیزه کردن و استفاده از بافر لیز را می توانید در کلیپ های زیر مشاهده کنید:

 

 

 

مساله: RNA خرد شده / اینتگریتی پایین

باندهای rRNA به صورت اسمیر در ژل دیده می شوند یا باندهای ۱۸s از ۲۸s شارپتر هستند. در آنالیزور Agilent شما پیکهای بزرگتری را در ۱۸s می بینید.

علت:

در حین فرایند، خرد شدگی در برخی نقاط رخ می دهد که اشاره دقیق به آنها مشکل است. می تواند در هنگام جمع آوری یا ذخیره رخ داده باشد یا هنگام استخراج. همچنین می تواند در بعد از تخلیص رخ دهد.

جداسازی RNA با ترایزول

استخراج RNA با الکل

 

راه حل:

اگر مشکل در زمان ذخیره سازی ایجاد شود، مطمئن شوید که نمونه ها درست بعد از جمع آوری فریز شوند. از نیتروژن مایع یا دمای -۸۰ᵒC برای ذخیره سازی استفاده کنید. برای بافت از محلولهای نگهداری RNA استفاده کنید و در  -۲۰ᵒC ذخیره سازی را انجام دهید.

اگر مشکل در هنگام استخراج اتفاق افتاد، سعی کنید از بتا مرکاپتواتانول (BME) در بافر لیز استفاده کنید. از ۱۰ مایکرولیتر BME 14.3 M  برای هر ۱ml بافر لیز استفاده کنید. BME آنزیم RNase ها را از بین می برد و به پایداری نمونه در حین استخراج کمک می کند.

اگر نمونه را از فریزر خارج کردید و در یک محلول نگهدارنده نبود، آن را آب نکنید. آن را با BME هوموژنیزه کنید. فراموش نکنید هیچ تکه ای از بافت باقی نماند و کاملا لیز شود.

بعد از استخراج می توانید از RNase استفاده کنید. مطمئن باشید آبی که برای الوشن یا محلول کردن پلت ها استفاده می شود RNase free باشد. بسیاری از کیت ها برای کار با RNA، آبی را در خود دارند که با DEPC تیمار شده یا به روش های دیگر خالص سازی شده است.

 

مساله: مهارکننده ها در RNA

اگر RNA به طور غیر طبیعی دارای جذب در ۲۶۰/۲۳۰ یا ۲۶۰/۲۸۰ عدد کمتر از ۱ باشد یا در ترنسکریپتاز معکوس کار نکند.

علت:

جذب پایین ۲۶۰/۲۳۰ نشان دهنده وجود نمک گوانیدین یا مهارکننده های معدنی (از قبیل هیومیک اسید یا پلی ساکاریدها در نمونه های محیطی) می باشد. نمک گوانیدین در ترایزول و کیت های سیلیکا وجود دارد. این نمک ها RNase را غیرفعال می کنند، اما علاوه بر آن آنزیم های RT را هم در صورت بودن در RNA نهایی غیرفعال می کنند. ۲۶۰/۲۸۰ پایین نشان دهنده وجود پروتئین است.

 

راه حل:

برای خوانش های ۲۶۰/۲۳۰ پایین، بهترین کار شستن بیشتر نمونه های RNA است. اگر نمونه ها مربوط به رسوب دهی با ترایزول باشد، سعی کنید آن را با اتانول بشویید تا نمک زدایی شود. برای پرپ های سیلیکا ، چند بار شستشو با اتانول ۷۰-۸۰% می تواند ستون را از نمک پاک کند. برای نمونه هایی هم که خالص سازی شده اند ولی هنوز پاک نشدند، از اتانول برای رسوبدهی RNA و نمک زدایی استفاده کنید.

برای دیگر مواد مهارکننده، از قبیل هیومیک اسید و پلی ساکاریدها، ممکن است نیاز پیدا کنید تا نمونه را در یک ستون دیگر مجدد تخلیص کنید و آنرا خوب شستشو دهید بعد الوت کنید. برخی از این مواد با روش های مرسوم از RNA (یا DNA) حذف نمی شوند. زیرا آنها خیلی شبیه نوکلئیک اسیدها هستند. در این مورد، شما باید از تکنولوژی حذف مهارکننده ها برای نمونه ها محیطی استفاده کنید.

 خوانش ۲۶۰/۲۸۰ پایین معمولا به علت وجود میزان زیاد پروتئین بوده که در اثر استفاده از نمونه بیشتر از اندازه توصیه شده کیت است. سعی کنید نمونه را با یک دور دیگر از روش خود تمیز کنید. فنول-کلروفرم و رسوب دهی یا نمک های اتصال (Binding) و اتانول را اضافه کنید و از یک ستون سیلیکای اسپین دیگر استفاده کنید.

 

میزان پایین RNA بعد از استخراج RNA

میزان RNA کمتر از حد انتظار باشد – با توجه به نتایج قبلی شما، یا بر اساس گزارشاتی که از نمونه های خاص منتشر شده است. میزان RNA می تواند بین انواع سلول کشت شده و بافت های مختلف متفاوت باشد. برای RNA خون این میزان حتی فرد با فرد متفاوت است.

علت:

اگر میزان RNA کمتر از حد تصور باشد و یا می دانید که باید باشد و RNA دست نخورده مانده (خرد نشده)، ممکن است هوموژنیزاسیون کامل انجام نشده است. برای استخراج RNA یک هضم (lysis) قوی لازم است.

هوموژن کردن بافت هایی که در RNALater ذخیره شده اند کمی سخت تر است. اشتباه در وزن کردن بافت یا در شمارش سلول ها می تواند منجر به کاهش میزان RNA دریافتی گردد. در مورد RNA خون، بافی کوت ها می توانند با توجه به مهارت کاربر و در هر بیمار متفاوت باشند.

 

راه حل:

در موردهایی که میزان RNA پایین است ولی RNA سالم است، بر روی هوموژنیزاسیون تمرکز کنید، ببینید آیا DNA ژنومی را خوب خرد کرده اید و RNA را از تمامی سلول آزاد کرده اید یا خیر. اگر در محلول هوموژن شده خود تکه های بافت دیدید شما RNA را از دست داده اید.

وزن کردن قطعات کوچک بافت دشوار است، بنابراین مطمئن شوید که از مقیاس دقیق برای این کار استفاده می کنید که همان وزن دلخواه شما را می دهد. ممکن است تفاوت هایی در تیوب با تیوب و یا دیگر مشکلاتی در خلوص مانند بسته شدن ستون ها به علت استفاده بیش از حد ببینید. اگر ثبات برای شما مهم است در مورد سلول ها شمارش دقیق بسیار ضروری است.

اگر RNA به نظر خرد شده آمد بعلاوه میزان آن پایین بود، نشان می دهد که هوموژنیزاسیون شدید بوده و نمونه برای مدت زیادی حرارت دیده. سعی کنید ۳۰-۴۰ ثانیه هوموژن کنید و ۳۰ ثانیه استراحت بدهید. از برش خود بر روی بافت مطمئن شوید و آن را به سرعت در بافر لیز گوانیدین سرد (یا ترایزول) قرار دهید تا از فعالیت RNase در هنگام آماده سازی جلوگیری کند.

در هنگام استفاده از اسپین فیلترهای سیلیکا از اینکه بافر الوشن به اندازه کافی باشد مطمئن شوید تا RNA را به طور کامل از غشا آزاد کند. آب بیشتر می تواند RNA بیشتری را آزاد کند، بنابراین تا جایی که غلظت اجازه می دهد از الوت بیشتری استفاده کنید. سعی نکنید از بافر الوت کمتری نسبت به آنچه در دستورالعمل پیشنهاد داده استفاده کنید زیرا منجر به ماندن RNA بر روی غشا می شود. اگر نهایت بازیابی مد نظر است، بعد از رسوبدهی با اتانول بهتر است از الوت بیشتر و غلیظتر استفاده شود.

 

در آخر

جداسازی RNA بدون در نظر گرفتن منبع نمونه از روش یکسانی پیروی می کند. برای همه نمونه ها، هوموژنیزاسیون اولین مرحله و مهمترین آن است. یک هوموژنیزاسیون خوب نیاز به شکست سلولی و غیرفعال کردن سریع RNase در بافر لیز دارد و همچنین خرد کردن DNA ژنومی برای اطمینان از حذف بهتر آن.

 

اگر این مطلب نظرتان را جلب کرد لطفا با دوستانتان در میان بگذارید