تعیین غلظت و خلوص DNA

 

کاملترین راه برای بدست آوردن تعیین غلظت و خلوص DNA استفاده از روشهای اندازه گیری اسپکتروفتومتری UV و الکتروفورز ژل آگارز می باشد. این مقاله، مروری است بر این دوروش کاربردی.

اسپکتروفوتومتری UV مولکول DNA و تعیین خلوص آن

DNA خودش و همچنین درگر آلودگیهای موجود در ماده استخراجی حاوی DNA دارای جذب نوری ۲۳۰nm تا ۳۲۰nm می باشند. بنابراین، اندازه گیری مقدار جذب زمینه اندازه گیری میزان DNA را امکان پذیر می کند و همچنین اطلاعاتی راجع به میزان آلودگی ها می دهد. این انازه گیری از طریق اسپکتروفوتومترهای رایج یا دستگاه هایی که برای آنالیز بیومولکول ها ساخته شده اند استفاده می شود. زمانی که اندازه ها خوانده می شود مهمترین طول موج ها شامل موارد ذیل هستند.

 

۲۳۰nm:

نمک های گوانیدینیوم (Guanidinium) که به منظور تسهیل اتصال DNA به ستون های سیلیکا استفاده می شوند و فنول (در استخراج های روش فنول/ کلوروفرم استفاده می شود) در ۲۳۰nm جذب بسیار قوی دارند. لذا جذب بالا در این طول موج  نشانگر وجود این مواد در نمونه است.

 

۲۶۰nm:

DNA جذب بسیار بالایی در ۲۶۰nm دارد لذا جذب نوری در این طول موج (A۲۶۰  نامیده می شود) برای مشخص کردن غلظت DNA ازمعادله زیر که مشتق شده از قانون بیر است استفاده می شود.

Concentration (µg/ml) = (A۲۶۰ reading – A۳۲۰ reading) x 50

۲۸۰nm:

اسید آمینه های تیروزین و تریپتوفان در این طول موج دارای جذب بسیار بالایی هستند. جذب در ۲۸۰nm به منظور بررسی وجود ناخالصی پروتئین استفاده می شود.

۲۳۰nm:

A۲۳۰  میزانی از کدورت کلی نمونه را نشان می دهد و به طور معمول از A260 جدا شده و به صورت یک پس زمینه برای محاسبه غلظت DNA استفاده می شود. مقادیر بیش از حد آن نشان دنده آلودگی های غیر اختصاصی است.

DNA با کیفیت بالا باید دارای نسبت  A۲۸۰/ A۲۶۰ از ۱.۷ الی ۲ و  A۲۳۰ /A۲۶۰ بالاتر از ۱.۵ باشد. اما با توجه به اینکه حساسیت تکنیک های مختلف به این آلودگی ها متفاوت است، این عدد باید تنها راهنمایی برای خلوص نمونه شما باشد. برای یک اندازه گیری صحیح،  اندازه A۲۶۰ باید بین ۰.۱ تا ۱ باشد . در نتیجه ممکن است نیاز به رقیق سازی نمونه های غلیظ باید.

 

اندازه گیری غلظت DNA و خلوص آن بوسیله الکتروفورز ژل آگارز

ایرادی که اندازه گیری های اسپکتروفوتومتری دارد این است که آلودگی هایی از قبیل DNA ژنومی (برای مثال یک آلودگی در پرپ های پلازمید) ، RNA، گوانیدین و پروتئین ها همگی یک میزان جذبی در طول موج ۲۶۰nm دارند. بنابراین، اگر به میزان زیاد در نمونه باشند پس از خوانش A۲۶۰ منجر به نشان دادن عدد بالاتری در غلظت DNA می شوند.

استفاده از الکتروفورز ژل آگاروز و رنگ های کمی مانند اتیدیوم بروماید می توانند جایگزینی برای محاسبه غلظت نمونه DNA که تحت نتاثیر این آلودگی های نبوده باشد.

غلظت DNA یک نمونه را می توان تقریباً با مقایسه شدت باند نمونه با یک باند نشانگر وزن مولکولی که محتوای DNA آن مشخص است محاسبه کرد( لدر DNA).

آلودگی های RNA را هم می توان با مشاهده اسمیر هایی که دیده می شود بر روی ژل شناسایی نمود چون RNA دارای وزن مولکولی پایینی است و از DNA که دارای وزن بالای مولکولی است قابل تشخیص است.

علاوه بر این ، نشانه مهم در مورد کیفیت DNA پلاسمید تهیه شده توسط لیز قلیایی  (mini/midi preps) این است که دناتوراسیون دائم DNA که از طریق انکوباسیون طولانی DNA در بافر لیز حاصل می شود منجر به حرکت کندتر DNA از حد موردانتظار بر روی ژل آگاروز می گردد.

روش اندازه گیری اسپکتروفتومتری UV برای تعیین غظت DNA و خلوص آن

DNA وبسیاری از آلودگی های آن