دسته‌هاPCR & Real time PCR

NGS و تشخیص بالینی

در این مقاله به نکاتی در مورد NGS و تشخیص بالینی و چالش های پیش روی آن می پردازیم.

سی و پنج سال پیش ، دکتر Janet Davison Rowley در آزمایشگاهش در دانشگاه شیکاگو پشت میکروسکوپ نشسته بود و کشف بزرگی در زمیته سرطان انجام داد، وی نشان داد که لوسمی در اثر ترنسلوکاسیون کروموزومی اتفاق می افتد. به مفهوم دیگر این یک بیماری DNA است. امروز با کمک NGS (Next generation sequencing) ما می توانیم بر روی آن کروموزوم و بقیه آنها تمرکز کنیم و نشان دهیم کدام نوکلئوتیدعامل بیماری بوده است.

به سمت پزشکی شخصی

اولین توالی یابی ژنوم انسان در سال 2003 میلیارها دلار هزینه داشت و نزدیک  به یک دهه به طول انجامید. امروزه هزینه این کار کمتر از 1000 دلار است و این رقم به ازای هر باز در حال کاهش است. پیشرفت های حاصل شده در زمینه ذخیره سازی داده ها و انباشت توالی های بدست آمده منجر به کنترل بهتر در زمینه مدیریت داده و آنالیز آن شده است. اکنون NGS توانسته ما را یک قدم به پزشکی شخصی نزدیکتر کند. در این مقاله نمونه هایی از یافته های پزشکی شخصی را می خوانید که با کمک NGS به انجام رسیده است.

نقش بیماری های تک ژنی (Monogenic) در مرگ نوزادان

بیماری های تک ژنی یا بیماری حاصل از موتاسیون در یک ژن یکی از دلایل رایج مرگ نوزادان است. اگرچه بیش از 3500 بیماری ژنتیکی تا به امروز مشخص شده است، تنها تعدادی از آنها دارای تست غربالگری است. در یک مطالعه که در بیمارستان کودکان Mercy در کانزاس انجام شد، به منظور تشخیص مولکولی علل بیماری کودکان تعیین توالی کل ژنوم (WGS) انجام گرفت. 2 نمونه توالی یابی شدند. 50 ساعت آماده سازی نمونه ها، ساخت کتابخانه (Library)، توالی یابی و آنالیز  به طول انجامید . این نمونه ها با دستگاه Illumina Hiseq 2500, 2×100 با کاوریج 50X خوانش شدند. آنالیز نمونه ها با کمک نرم افزار RUNES ( نرم افزار فراخوانی واریانت) دو ساعت و نیم به طول انجامید. این فرآیند منجر به کشف دو موتاسیون هتروزیگوت معنی دار شد. این یک نمونه از مزایای NGS است و در مواقعی که نمی دانیم دقیقا در کدام قسمت باید متمرکز شویم به کمک ما می آید.

داستان یک نجات یافته از سرطان … و محقق

دکتر Lukas Wartman زمانی که بر روی سرطان در دانشگاه واشینگتن مطالعه می کرد، مبتلا به لوسمی حاد لیمفوبلاستیک شد. پس از شیمی درمانی و دو سال بهبود او اولین عود بیماری را تجربه کرد. زمانی که بیماری او بعد از پیوند مغز استخوان عود کرد، NGS به عنوان ابزاری تایید شده که نشان می داد دقیقا چه در بدن افتاده است مطرح شد. وی ژنوم خود را در انستیتو  Genome دانشگاه واشینگتن آزمایش نمود. آنالیز ترنسکریپتوم نشان داد که سطح بیان پروتئین FLT3 وی بالا رفته است، که یک ژن تنظیم کننده رشد است. خوشبختانه یه داروی مهار کننده FLT3 که تاییدیه FDA را داشت برای درمان سرطان کلیه وجود داشت. جدا از اینکه شرکت های بیمه هزینه این دارو را پرداخت نمی کنند هیچ مانعی برای تست این دارو در بیماری لوسمی حاد لیمفوبلاستیک نبود. بدن دکتر Lukas به این دارو پاسخ مثبت داد و درمان شد. شما می توانید در مورد داستان وی در اینجا بخوانید.

 

تشخیص آنتی ژن لوکوسیت انسانی

خانواده ژنی آنتی ژن لوکوسیت انسانی (HLA) شامل ژن هایی است که مجموعه پروتئینی HLA را بیان می کند. این مجموعه در توانایی سیستم ایمنی بدن برای تشخیص پروتئین های خود فرد از پروتئین های خارجی نقش مهمی دارد (برای مثال میکروبها، انگلها و در پیوند). HLA آنالوگ مجموعه سازگاری نسجی (MHC) که در بسیاری از دیگر گونه ها دیده می شود است. مجموعه HLA متشکل از  بیش از 200 ژن در کروموزوم 6 است و درک این ژن جهت پیوند اعضا و جلوگیری از پس زدن بافت توسط سیستم ایمنی فرد گیرنده بسیار ضروری است. (برای مثال: گرفت در مقابل بیماری فرد گیرنده). در این خصوص NGS این امکان را فرآهم آورده که از طریق HLA typing و HLA maching افراد گیرنده عضو، بهترین شانس را در انجام یک پیوند عضو موفق داشته باشند.

چالش های NGS برای تبدیل شدن به یک ابزار تشخیصی

با وجود کاهش هزینه ها، هنوز چالش های زیادی برای تبدیل شدن NGS به یک پایه اصلی در تمام آزمایشگاه های تشخیصی وجود دارد. ابزارهای مورد نیاز برای اجرای داخلی NGS گران است و راه اندازی مرکز NGS و تجزیه و تحلیل داده های آن زمانبر بوده و نیاز به پرسنل متخصص دارد. تعیین توالی کل ژنوم یا کل اگزوم می تواند از آماده سازی نمونه تا توالی یابی و آنالیز چند هفته به طول بیانجامد. زمان بهینه برای یک تست تشخیصی بین یک الی سه روز می باشد. توالی یابی در چندین پلتفرم با کاوریج بالاتر حتی می تواند به مبلغ و زمان انجام کار بیافزاید. چالش های فنی هم مانند توالی های غنی از GC وجود دارد که نیاز به توالی یابی عمیق تر و تغییر در استراتژی های تجزیه و تحلیل دارد.

حریم خصوصی و NGS

از دیگر جنبه های مهم، حریم خصوصی است. زمانی که تشخیص بیماری مد نظر باشد، ساخت لایبری، توالی یابی و آنالیز اصلی ترین بخشهای NGS خواهند بود. در یازدهم اکتبر 2012، کمیسیون اخلاق زیستی ریاست جمهوری ایالات متحده آمریکا گزارش مهمی را با عنوان حریم خصوصی و پیشرفت در NGS  منتشر کرد. این گزارش توصیه می کند که NGS بدون اجازه فرد انجام نشود ، از اطلاعات بدست آمده از توالی یابی محافظت شود و مشاوره به عنوان پیش شرط آزمایش ژنتیک قبل از WGS انجام شود. این توصیه نامه ها به ایجاد اطمینان از حفظ حریم خصوصی افراد کمک می کند. به عنوان مثال توالی یابی بقایای به جا مانده بر روی فنجان قهوه یا بشقاب ها از جمله آزمایشات است.

اخلاق در NGS و آموزش

آخرین و البته مهمترین مساله در WGS کشف اطلاعاتی است که بیمار ممکن است دریافت نکرده باشد. آنالیزها ممکن است منجر به تشخیص موارد مشخص نشده  شود که ممکن است دارای درمان باشند یا خیر. از سمتی دیگر آنالیزها می توانند منجر به دیده شدن موتاسیونی گردند که منجر به بیماری بشود یا خیر. ژنومیکس شخصی ابزاری است که به سرعت همه گیر شد و سوالات بسیاری بزرگ اخلاقی ایجاد نمود. از جمله این سوالات می توان به موارد زیر اشاره نمود:

  • آیا مشاوره اختصاصی بیماری به صورت موازی با NGS ابزار تشخیصی هستند؟
  • ما چگونه کمک کنیم تا مردم به پتانسیل اطلاعات پی ببرند تا این فرآیند فعال باشد و از آن سوء استفاده نشود.

منابع:

 

  1. Goldberg B, Sichtig H, Geyer C, Ledeboer N, Weinstock GM. 2015. Making the Leap from Research Laboratory to Clinic: Challenges and Opportunities for Next-Generation Sequencing in Infectious Disease Diagnostics. mBio. 6(6): e01888-15.
  2. Kamps R, Brandao RD, van den Bosch BJ, Paulussen ADC, Xanthoulea S, Blok MJ, Romano A. 2017. Next-Generation Sequencing in Oncology: Genetic Diagnosis, Risk Prediction and Cancer Classification. Int J Mol Sci. 18(2): 308.
  3. Rigter T, Henneman L, Kristoffersson U, Hall A, Yntema HG, Borry P, Tönnies H, Waisfisz Q, Elting MW, Dondorp WJ, Cornel MC. 2013. Reflecting on Earlier Experiences with Unsolicited Findings: Points to Consider for Next-Generation Sequencing and Informed Consent in Diagnostics. Hum Mutat. 34/10):1322-1328.

دسته‌هامحلول سازی

ساخت محلول های آزمایشگاهی

محلولEDTA  یا Ethylenediaminetetraacetic acid با مولاریته 0.5M و pH 8 به صورت روتین در مراکز به عنوان لیگاند یا عامل شلاته کننده استقاده می شود. EDTA معمولا برای جمع آوری یون های فلزی از محلول مانند +Ca2 و +Mg2 به کار می رود. از آنجایی که نوکلئاز ها برای خرد کردن DNA و RNA به یون های فلزی نیاز دارند، لذا استفاده از  EDTA می تواند از این عمل جلوگیری کند.

روش تهیه:

روش کار زیر برای تهیه 100ml از محلول EDTA 0.5M  pH 8 استفاده می شود

ماده

حجم/ وزن

غلظت نهایی

EDTA disodium salt, dihydrate

18.61g

0.5M

dH2O80ml

 

  • 18.61 گرم از EDTA را وزن کنید و در یک بطری 100ml بریزید
  • 80ml آب دیونیزه را به بطری اضافه کنید
  • یک مگنت درون بطری بیاندازید و بر روی استیرر قرار دهید . EDTA تا زمانی که به pH 8 نرسد حل نمی شود
  • از pH متر برای اندازه گیری pH استفاده کنید
  • برای اینکه pH را به میزان دلخواه برسانیم (pH 8) از قرص های NaOH استفاده می کنیم. چند عدد قرص را داخل بطری بیاندازید و اجازه دهید خوب حل شود. اگر هنوز EDTA حل نشده بود مجدد چند عدد قرص اضافه کنید. تقریبا به اندازه 2 گرم قرص برای این کار نیاز است تا pH به 8 برسد
  • هنگامی که محلول شفاف شد با اضافه کردن آب دیونیزه آن را به 100ml برسانید.
  • جهت اسریل کردن می توانید آن را در اتوکلاو قرار دهید.

نگهداری محلول EDTA 0.5M pH 8

این محلول در دمای 15الی 25 درجه سانتیگراد در اتاق نگهداری می شود

ایمنی

محلول EDTA 0.5M pH 8 به عنوان ماده خطرناک طبقه بندی نمی شود. اما همیشه برگه ایمنی را مطالعه نمایید.

منبع

دسته‌هاکسب و کار

بازاریابی و فروش در ایام شیوع ویروس کرونا

بازاریابی و فروش در شیوع ویروس کرونا

بسیاری از کسب و کارها روزهای سختی را پشت سر می گذارند. در این شرایط نکاتی وجود دارد که می تواند در خصوص بازاریابی در ایام شیوع کرونا به پیشبرد عملکرد و بقای کسب و کار کمک کند. قطعا با توجه به موقعیت و حیطه کاری هر مجموعه، تمامی راه کارها مناسب نیستند ولی امیدوارم این مطلب هرچند کوچک برای شما مفید واقع گردد.

نکاتی در مورد بازاریابی در ایام شیوع کرونا:

  • کار بر روی سایت شرکت: جایی که مشتریان ما را به صورت آنلاین می توانند بیابند. دنبال مواردی باشیم که در محصولات و یا خدماتمان تا به حال در سایت قرار ندادیم. در عکس ها و لینک های سایت بازبینی داشته باشیم و بررسی کنیم که کار باشند.
  • مطلب گذاری در سایت: همچنان حیطه های گوناگون مرتبطی وجود دارند که در سایت شرکت بیان نشده اند. با انتخاب مطالب مناسب و ارائه این موضوعات در سایت در موتورهای جستجو جایگاهی پیدا کنیم.
  • انجام کارهای جدید و تقویت راه های ارتباطی: مانند شبکه های اجتماعی جدید که قبلا در آن نبوده ایم، ایجاد پادکست، یا تقویت شبکه های اجتماعی مانند اینستاگرام و تلگرام، الان زمان مناسبی برای این کار است.
  • برقراری ارتباطات اینترنتی با مشتریان، واتساپ، اسکایپ و غیره..
  • طبیعی است که مراقب بودجه بازاریابی باشید اما می توانید با تغییر استراتژی بودجه های آن را به سمت بازاریابی دیجیتال انتقال دهید.
  • در رکود اقتصادی 2008 -2009 بسیاری از شرکت ها هزینه های بازاریابی را کاهش دادند اما به عنوان مثال ، تجزیه و تحلیل مک کینزی در مورد شرکتهای که رکود اقتصادی داشتند نشان داد که هر دو عمل کاهش هزینه و همچنین اقدام به افزایش فروش و هزینه های بازاریابی می توانند وضعیت یک شرکت را در مرحله بهبود قرار بدهند.

همانطور که جان کوئلچ در سال 2008 در Financial Times عنوان کرد: “به خوبی ثابت شده است که برند های تبلیغاتی در زمان رکود اقتصادی افزایش می یابند، به این علت که وقتی رقبا عقب می افتند، می توانند سهم بازار را به خود اختصاص دهند و سرمایه گذاری را با هزینه کمتری نسبت به زمان خوب اقتصادی انجام دهند.”

ادامه نکات:

  • در مورد شرکت هایی که سرمایه دارند، از آنجایی که احتمالا بعد از آنکه بازار مساعد شد تورم هم وجود خواهد داشت، می توانند مواد اولیه بیشتری تهیه کنند.
  • در این مدت فروش اعتباری خود را باید کنترل کنید، چراکه ممکن است، اعتباری که می دهید به زودی به سیستم برنگردد.
  • مطمئن شوید محصولی که می فروشید در انبار مشتریان انبار نشود، چون ممکن است به همین دلیل نتوانید از آنها مبلغی دریافت کنید.
  • از تخفیفات نقدی استفاده کنید.
  • هزینه ها را مدیریت کنید، بیرون کردن کارمندان آخرین گزینه است.
  • به این باور داشته باشید که این شرایط همیشگی نیست و روزی به پایان می رسد. لذا امید خورد را از دست ندهید و به دنبال راه حل هایی باشید که به شما کمک می کنند تا این دوران را با حداقل آسیب پشت سر بگذارید.

در این مقاله بازاریابی در ایام شیوع کرونا را بررسی کردیم، امیدوارم از این نکات استفاده لازم را برده باشید. نظرات و پیشنهادات خود را برای ما ارسال کنید.

منابع:

 

دسته‌هاPCR & Real time PCR

8 نکته برای خرید دستگاه PCR

با دستگاه PCR مناسب میزان موفقیت خود را بالا ببرید

 

امروزه همه آزمایشگاه ها دستگاه PCR دارند. از نوع قابل حمل دارای باتری داخلی گرفته تا انواع دستگاه که ریل تایم هم انجام می دهند و مدل های دیگر که دارای انواع مزایا هستند. فرض کنید اگر قرار باشد شما بخواهید دستگاه PCR قدیمی موجود در آزمایشگاه را  تعویض کنید دنبال چه دستگاهی می گردید؟

ما در این مقاله به نکاتی اشاره می کنیم که فارغ از بحث قیمت دستگاه می تواند شما را در خرید یک دستگاه کارامد کمک کند.

 

  • ظرفیت نمونه دستگاه PCR

از جمله امکاناتی که یک دستگاه PCR خوب اید داشته باشد تطبیق پذیری آن با تک تیوب های 0.2ml، تیوب های استریپ و پلیت های چندین خانه است. درسته که ممکن است شما هیچ وقت پلیت 96 خانه در دستگاه قرار ندهید ولی در آینده ممکن است آزمایشگاه به این قابلیت نیاز داشته باشد.

در دستگاه PCR به استفاده از پلیت های حاشیه دار (Skirted)  و یا بدون حاشیه (unskirted) وابسته است. اگر آزمایشگاه شما از پلیت های چندین خانه استفاده می کند( و نه از دیگر انواع)، و آنها با PCR سازگارند، خرید دستگاه باید طوری باشد که بتوان در آن از این پلیت ها استفاده نمود و بصرفه باشد.

 

 

 

دستگاه PCR
skirted PCR plate

 

دستگاه PCR
non skirted PCR plate

 

  • حجم واکنش، بلاک نمونه قابل تعویض در دستگاه PCR

برخی از بلاک  های نمونه ترمال سایکلر از نمونه های با حجم بالا از قبیل تیوب های 0.5ml استفاده می کنند، البته تعداد نمونه هایی که بتوان PCR کرد کم خواهد شد. برای اینکه این گزینه را هم باز بگذارید می توانید دستگاه هایی را مد نظر بگیرید که دارای چندین بلاک  قابل تعویض هستند. این راه خوبی برای حفظ فضا است و به راحتی می توانید در زمان احتیاج یک بلاک  دیگر سفارش دهید، به جای اینکه یک دستگاه دیگر بخرید.

حتی این موضوع می تواند راه موثری برای کاهش آلودگی بین نمونه ای باشد. می توانید برای هر نوع نمونه یک بلاک  را استفاده کنید. در واقع این قابلیت در آزمایشگاه هایی که هم نمونه باکتری و هم انسانی کار می کنند موثر است.

 

دستگاه PCR
PCR Blocks

 

  • گستره دمایی و درجه های رمپ دستگاه PCR

     

اکثر واکنش های PCR براساس پروتوکل استاندارد انجام می شود. برخی از پروتوکل ها ( مانند آنهایی که به شدت نیاز به تغییرات زیاد در پرایمر یا مواد دارند) باید بهینه سازی مضاعف شوند. لذا داشتن این قابلیت در دستگاه که بتواند گستره دمایی مورد نیاز را فرآهم کند بسیار مهم است (برای مثال 0-100 ᵒC ).

قابل کنترل بودن درجه رمپ، یا سرعت سرد و گرم شدن برای رسیدن به دمای مورد نظر، حداقل امکانات دستگاه است، ولی خیلی مهم است. زیرا اگر سرعت پایین باشد ممکن است پرایمرها به مکان های غیر اختصاصی بچسبند. بنابراین هرچه درجه رپ سریعتر باشد موفقیت در PCR بیشتر است.

 

 

  • دقت درجه دمایی و یکنواختی دستگاه PCR

به خاطر داشته باشید که ممکن است مبادله ای بین سرعت رسیدن رمپ به دمای سیکل و دقت دمایی در آن ران وجود داشته باشد. سرعت بالا می تواند تغییراتی ایجاد کند. حداقل در qPCR اینگونه است. شما یک دستگاه PCR می خواهید که هر نمونه ای را در بلاک به یک اندازه حرارت دهد. در هر نقطه دمای یکسان ایجاد کند و ثابت بماند(مثبت و منفی تغییرات پایین باشد). در اینجا برگه خصوصیات دستگاه به کمک ما می آید، دستگاهی را انتخاب کنید که پایینترین محدوده ی +/- را در دما و دقت داشته باشد.

 

  • لیدهای حرارتی دستگاه PCR

در هنگام PCR، نمونه ها یا پلیت ها به صورت مستقیم با تماس مستقیم با بلاک  گرم می شوند. در بالای تیوبها بخشی وجود دارد که تماس مستقیم با بلاک ندارد. بدون لید های حرارتی ممکن است گرادیان گرم به سرد در تیوبها اتفاق بیافتد. ممکن است پایین تیوب بخار شود و در بالا متراکم شود. در واکنش هایی که حجم پایین دارند این موضوع می تواند تاثیر زیادی در غلظت اجزاء PCR ، انحراف نتایج qPCR، امکان جلوگیری از انجام درست PCR دارد.

خلاصه اینکه، لید های حرارتی بزرگترین ابزاریست که به یکنواختی هر واکنش PCR کمک می کند.

 

دستگاه PCR
how PCR machine lid works

 

  • انجام مجدد عملیات دستگاه PCR

     

دستگاهی که انتخاب می کنید باید دارای راه اندازی مجدد بعد قطع برق یا به هر دلیل متوقف شدن کار دستگاه باشد. این یک امکانی است که برخی کمپانی ها در دستگاه خود ارائه می دهند.

 

  • گرمایش منطقه ای 

     

داشتن امکان برقراری گرمایش منطقه ای در قسمت های مختلف بلاک. این خصوصیت به شما این امکان را می دهد تا دمای بهینه پرایمر را زودتر مشخص کنید. این تکنیک اصطلاحا PCR گرادیانت نام دارد و برای عیب یابی واکنش استفاده می شود.

 

دستگاه PCR
gradient PCR

 

دستگاه PCR
gradient PCR

 

 

  • سازگاری و مقیاس پذیری دستگاه PCR

هر دستگاه PCR باید از لحاظ تکنولوژی انعطاف پذیر باشد و با تکنولوژیهای آینده سازگاری داشته باشد، زیرا این خرید قرار است چند سال در آزمایشگاه کار کند. چه آزمایشگاه هر سایکلر خود را مجذا ران کند یا کنترل همه آنها را با موس و کیبرد داشته باشد. این محققان را ترغیب می کند تا با ذخیره کردن تنظیمات، برنامه ها و داده ها، همه در یک مکان با یکدیگر همکاری کنند.

به نظرتان چه امکانات دیگری را می توان در یک دستگاه PCR داشت؟ نظراتتان را با ما در میان بگذارید.

 

برای آشنایی با روشهای عیب یابی PCR اینجا کلیک نمایید.

 

  • منبع:

  1. Hilscher C, Vahrson W, Dittmer DP. (2005). Faster quantitative real-time PCR protocols may lose sensitivity and show increased variabilityNucleic Acids Research, 33(21):e182.
  2. bibesizebio

 

 

دسته‌هاPCR & Real time PCR

عیب یابی استخراج RNA

عیب یابی استخراج RNA

 

استخراج RNA یکی از پرکاربردترین روشها می باشد ولی بسیار ریزه کاری دارد. هر کسی که این کار را انجام داده است معمولا نکات و روش خودش را دارد که استخراج RNA را بدون نقص انجام دهد و یک RNA خوب داشته باشد. اگرچه RNA غیر قابل پیش بینی است آن هم به دلیل ناپایدار بودنش، ولی، مشکلات رایجی وجود دارد که قابل حل هستند.

 

مساله: وجود DNA ژنومی در RNA

RNA با DNA ژنومی الوت (Elute) می شود که نشانه آن وجود اسمیر با وزن بالا است. یا اینکه چیزی روی ژل دیده نمی شود ولی کنترل های منفی RT  موقع PCR تکثیر دارند.

علت:

مهم نیست چه روشی را برای استخراج RNA استفاده کرده اید، همیشه ردی از DNA می بینید. این موضوع در استفاده از ترایزول (فنول) و ستون های اسپین (Spin column) وجود دارد. علت آن می تواند به این دلیل باشد که در هنگام هوموژنیزاسیون، DNA به خوبی خرد نشده است. اگر از روش فنول استفاده می کنید، pH فنول یک نکته مهم است (باید اسیدی باشد) و شما باید مهارت این را داشته باشید که فقط فاز آبی را بکشید تا آلودگی DNA کمتری داشته باشید.

 

spin column RNA isolation

 

راه حل:

DNA ژنومی باید به خوبی هوموژن شود، باید از روشهایی استفاده شود که کامل DNA را بشکنند مانند high velocity bead beater و polytron rotor stator. در هنگام هوموژنیزاسیون نمونه ها گرم می شوند اما سرد کردن نمونه ها در گوانیدین باعث رسوب نمک می شود. بنابراین شما نیاز به تنظیم زمان هوموژنیزاسیون و زمان سرد کردن به اندازه دمای اتاق دارید.

 

high velocity bead beater
polytron rotor stater

 

بهترین راه برای حذف DNA ژنومی، تیمار با DNase است. برخی از کیتهای تجاری دارای DNase فعال و مقاوم به دما هستند که می توانند به طور کارآمدی آلودگی DNA  را حذف کنند. پس از حذف DNA، از یک رزین برای حذف DNase بدون گرما یا EDTA استفاده می شود. این نوع کیتها برای نمونه هایی که دارای مقدار زیادی DNA هستند (مانند بافت طحال)، برای نمونه هایی که با DNase خالص شده اند و زمانی که تیمار قسمتی از نمونه مورد نظر است استفاده می شوند. روش های برپایه ستون نیز می توانند برای نمونه هایی که دارای میزان کم DNA ژنومی هستند استفاده شوند.

 

نحوه هموژنیزه کردن و استفاده از بافر لیز را می توانید در کلیپ های زیر مشاهده کنید:

 

 

 

مساله: RNA خرد شده / اینتگریتی پایین

باندهای rRNA به صورت اسمیر در ژل دیده می شوند یا باندهای 18s از 28s شارپتر هستند. در آنالیزور Agilent شما پیکهای بزرگتری را در 18s می بینید.

علت:

در حین فرایند، خرد شدگی در برخی نقاط رخ می دهد که اشاره دقیق به آنها مشکل است. می تواند در هنگام جمع آوری یا ذخیره رخ داده باشد یا هنگام استخراج. همچنین می تواند در بعد از تخلیص رخ دهد.

جداسازی RNA با ترایزول

استخراج RNA با الکل

 

راه حل:

اگر مشکل در زمان ذخیره سازی ایجاد شود، مطمئن شوید که نمونه ها درست بعد از جمع آوری فریز شوند. از نیتروژن مایع یا دمای -80ᵒC برای ذخیره سازی استفاده کنید. برای بافت از محلولهای نگهداری RNA استفاده کنید و در  -20ᵒC ذخیره سازی را انجام دهید.

اگر مشکل در هنگام استخراج اتفاق افتاد، سعی کنید از بتا مرکاپتواتانول (BME) در بافر لیز استفاده کنید. از 10 مایکرولیتر BME 14.3 M  برای هر 1ml بافر لیز استفاده کنید. BME آنزیم RNase ها را از بین می برد و به پایداری نمونه در حین استخراج کمک می کند.

اگر نمونه را از فریزر خارج کردید و در یک محلول نگهدارنده نبود، آن را آب نکنید. آن را با BME هوموژنیزه کنید. فراموش نکنید هیچ تکه ای از بافت باقی نماند و کاملا لیز شود.

بعد از استخراج می توانید از RNase استفاده کنید. مطمئن باشید آبی که برای الوشن یا محلول کردن پلت ها استفاده می شود RNase free باشد. بسیاری از کیت ها برای کار با RNA، آبی را در خود دارند که با DEPC تیمار شده یا به روش های دیگر خالص سازی شده است.

 

مساله: مهارکننده ها در RNA

اگر RNA به طور غیر طبیعی دارای جذب در 260/230 یا 260/280 عدد کمتر از 1 باشد یا در ترنسکریپتاز معکوس کار نکند.

علت:

جذب پایین 260/230 نشان دهنده وجود نمک گوانیدین یا مهارکننده های معدنی (از قبیل هیومیک اسید یا پلی ساکاریدها در نمونه های محیطی) می باشد. نمک گوانیدین در ترایزول و کیت های سیلیکا وجود دارد. این نمک ها RNase را غیرفعال می کنند، اما علاوه بر آن آنزیم های RT را هم در صورت بودن در RNA نهایی غیرفعال می کنند. 260/280 پایین نشان دهنده وجود پروتئین است.

 

راه حل:

برای خوانش های 260/230 پایین، بهترین کار شستن بیشتر نمونه های RNA است. اگر نمونه ها مربوط به رسوب دهی با ترایزول باشد، سعی کنید آن را با اتانول بشویید تا نمک زدایی شود. برای پرپ های سیلیکا ، چند بار شستشو با اتانول 70-80% می تواند ستون را از نمک پاک کند. برای نمونه هایی هم که خالص سازی شده اند ولی هنوز پاک نشدند، از اتانول برای رسوبدهی RNA و نمک زدایی استفاده کنید.

برای دیگر مواد مهارکننده، از قبیل هیومیک اسید و پلی ساکاریدها، ممکن است نیاز پیدا کنید تا نمونه را در یک ستون دیگر مجدد تخلیص کنید و آنرا خوب شستشو دهید بعد الوت کنید. برخی از این مواد با روش های مرسوم از RNA (یا DNA) حذف نمی شوند. زیرا آنها خیلی شبیه نوکلئیک اسیدها هستند. در این مورد، شما باید از تکنولوژی حذف مهارکننده ها برای نمونه ها محیطی استفاده کنید.

 خوانش 260/280 پایین معمولا به علت وجود میزان زیاد پروتئین بوده که در اثر استفاده از نمونه بیشتر از اندازه توصیه شده کیت است. سعی کنید نمونه را با یک دور دیگر از روش خود تمیز کنید. فنول-کلروفرم و رسوب دهی یا نمک های اتصال (Binding) و اتانول را اضافه کنید و از یک ستون سیلیکای اسپین دیگر استفاده کنید.

 

میزان پایین RNA بعد از استخراج RNA

میزان RNA کمتر از حد انتظار باشد – با توجه به نتایج قبلی شما، یا بر اساس گزارشاتی که از نمونه های خاص منتشر شده است. میزان RNA می تواند بین انواع سلول کشت شده و بافت های مختلف متفاوت باشد. برای RNA خون این میزان حتی فرد با فرد متفاوت است.

علت:

اگر میزان RNA کمتر از حد تصور باشد و یا می دانید که باید باشد و RNA دست نخورده مانده (خرد نشده)، ممکن است هوموژنیزاسیون کامل انجام نشده است. برای استخراج RNA یک هضم (lysis) قوی لازم است.

هوموژن کردن بافت هایی که در RNALater ذخیره شده اند کمی سخت تر است. اشتباه در وزن کردن بافت یا در شمارش سلول ها می تواند منجر به کاهش میزان RNA دریافتی گردد. در مورد RNA خون، بافی کوت ها می توانند با توجه به مهارت کاربر و در هر بیمار متفاوت باشند.

 

راه حل:

در موردهایی که میزان RNA پایین است ولی RNA سالم است، بر روی هوموژنیزاسیون تمرکز کنید، ببینید آیا DNA ژنومی را خوب خرد کرده اید و RNA را از تمامی سلول آزاد کرده اید یا خیر. اگر در محلول هوموژن شده خود تکه های بافت دیدید شما RNA را از دست داده اید.

وزن کردن قطعات کوچک بافت دشوار است، بنابراین مطمئن شوید که از مقیاس دقیق برای این کار استفاده می کنید که همان وزن دلخواه شما را می دهد. ممکن است تفاوت هایی در تیوب با تیوب و یا دیگر مشکلاتی در خلوص مانند بسته شدن ستون ها به علت استفاده بیش از حد ببینید. اگر ثبات برای شما مهم است در مورد سلول ها شمارش دقیق بسیار ضروری است.

اگر RNA به نظر خرد شده آمد بعلاوه میزان آن پایین بود، نشان می دهد که هوموژنیزاسیون شدید بوده و نمونه برای مدت زیادی حرارت دیده. سعی کنید 30-40 ثانیه هوموژن کنید و 30 ثانیه استراحت بدهید. از برش خود بر روی بافت مطمئن شوید و آن را به سرعت در بافر لیز گوانیدین سرد (یا ترایزول) قرار دهید تا از فعالیت RNase در هنگام آماده سازی جلوگیری کند.

در هنگام استفاده از اسپین فیلترهای سیلیکا از اینکه بافر الوشن به اندازه کافی باشد مطمئن شوید تا RNA را به طور کامل از غشا آزاد کند. آب بیشتر می تواند RNA بیشتری را آزاد کند، بنابراین تا جایی که غلظت اجازه می دهد از الوت بیشتری استفاده کنید. سعی نکنید از بافر الوت کمتری نسبت به آنچه در دستورالعمل پیشنهاد داده استفاده کنید زیرا منجر به ماندن RNA بر روی غشا می شود. اگر نهایت بازیابی مد نظر است، بعد از رسوبدهی با اتانول بهتر است از الوت بیشتر و غلیظتر استفاده شود.

 

در آخر

جداسازی RNA بدون در نظر گرفتن منبع نمونه از روش یکسانی پیروی می کند. برای همه نمونه ها، هوموژنیزاسیون اولین مرحله و مهمترین آن است. یک هوموژنیزاسیون خوب نیاز به شکست سلولی و غیرفعال کردن سریع RNase در بافر لیز دارد و همچنین خرد کردن DNA ژنومی برای اطمینان از حذف بهتر آن.

 

اگر این مطلب نظرتان را جلب کرد لطفا با دوستانتان در میان بگذارید

دسته‌هاPCR & Real time PCR

استخراج پلاسمید با بافر قلیایی

استخراج پلاسمید با بافر قلیلیی

اولین بار لیز قلیایی به وسیله Birnboim  و دالی در سال 1979 مطرح شد (Nucleic Acids Res. 7, 1513-1523) و با کمی تغییرات اکنون سالهاست که به عنوان روشی مناسب برای استخراج  پلاسمید استفاده می شود. راحت ترین راه برای توضیح اینکه لیز قلیایی چگونه انجام می شود این است که نگاهی به فرآیند آن بیاندازیم، پس ببینیم..

 

  • رشد سلولی و برداشت آن

این فرآیند با رشد دادن سلول های باکتری در محیط کشت انجام می شود، باکتریهایی که حاوی پلاسمید مورد نظر هستند. هنگامی که سلول ها به رشد کافی رسیدند، برای خارج کردن آنها از محیط کشت پلت گیری انجام می شود یعنی به وسیله سانتریفیوژ رسوب داده و از محیط خارج می شوند.

  • معلق سازی ( re-suspension) در استخراج پلاسمید

پلت مجددا در محلولی معلق می شود (معمولا محلول 1 یا مشابه آن) نامیده می شود. این محلول دارای Tris، EDTA، گلوکز و RNase A میباشد.

کاتیون های دو ظرفیتی (Mg2+، Ca2+) برای فعالیت DNase و تمامیت دیواره سلولی باکتری ضروری است. EDTA کاتیون های دو ظرفیتی را شلاته می کند و درنتیجه از آسیب رساندن DNase به پلاسمید جلوگیری می کند. بعلاوه، باعث ناپایداری دیواره سلولی می شود. گلوکز فشار اسمزی را ثابت نگه می دارد و بنابراین سلول ها متلاشی نمی شوند. RNase A نیز برای خرد کردن RNA سلولی در موقع لیز به کار می رود.

  • لیز سلولی در استخراج پلاسمید

بافر لیز ( محلول 2) دارای هیدروکسید سدیم (NaOH) و سدیم دو دسیل سولفات (SDS) است.  SDS در اینجا به کار می رود چون غشای سلولی را محلول می سازد و اکثر پروتئین های سلولی را دناتوره می کند که این کار بعدا در جدا کردن پروتئین ها و پلازمد کمک می کند.

NaOH به شکستن دیواره سلولی کمک می کند، و از طرفی از تشکیل پیوند هیدروژنی جفت بازهای DNA جلوگیری می کند. لذا، دو رشته DNA ژنومیک و پلازمید را به تک رشته ای تیدیل می کند. اسم این عمل دناتوره کردن نام دارد و قسمت میانی فرایند است.

بسیار مهم است که در طول این مرحله محلول معق شده و بافرهای لیز به خوبی ترکیب شوند البته نه خیلی به شدت. همچنین، به خاطر داشته باشید SDS و NaOH مضر هستند و پیشنهاد می شود حتما در هنگام کار با بافر قلیایی دستکش و محافظ چشم داشته باشید.

  • خنثی سازی (Neutralization) در استخراج پلاسمید

اضافه کردن پتاسیوم استات (محلول 3) منجر به کاهش مدرجه قلیایی محلول میشود. در این شرایط باندهای هیدروژنی بین بازهای تک رشته های DNA آماده شده و مجددا دورشته های DNA تشکیل می شود. هرچقدر که تشکیل دورشته حلقوی پلازمید راحت است، تشکیل دو رشته DNA ژنومی دشوار است و تقریبا دو رشته شدن کامل آن ممکن نیست. به این علت است که گفته می شود در حین فرآیند محلول ها را خیلی به شدت تکان ندهید زیرا این کار منجر به تشکیل رشته های کوتاه جدا شده می شود که مستعد تشکیل پیوند با تک رشته ای های پلاسمید هستند.

پلاسمید دو رشته ای به راحتی از محلول قابل دریافت است. DNA ژنومی تک رشته ای، SDS و پروتئین های دناتوره شده از طریق پیوندهای هیدروفوبیک به هم متصل می شوند و یک رسوب سفید رنگ را تشکیل می دهند. این رسوب به راحتی به وسیله سانتریفیوژ از پلاسمید جدا می شود.

  • پاکسازی و تغلیظ در استخراج پلاسمید

اکنون DNA پلاسمید شما از قسمت اعظم باقی مانده های سلولی جدا شده است اما هنوز محلول ها حاوی مقدار زیادی نمک  EDTA، RNase و اجزاء ریزتر پروتئینی و سلولی هستند لذا به هنوز کاملا مناسب کارهای بعدی نیستند. بنابراین قدم بعدی پاکسازی محلول و تغلیظ DNA پلاسمید است.

برای این کار راه های بسیاری وجود دارد که از جمله آن می توان به فنول –کلروفرم و بعد رسوب دهی با اتانول یا استفاده از ستون های کروماتوگرافی تمایلی که در شرایط نمکی و pH خاص به DNA پلاسمید متصل می شوند و در یک شرایط خاص دیگر آن را رها می کنند. رایج ترین روش ها را می توانید در مقاله 5  روش معمول برای تخلیص  DNA مطالعه نمایید.

منبع : The basics: How alkaline lysis works

 

اگر این مقاله مفید بود آن را به دوستانتان پیشنهاد کنید.

دسته‌هاPCR & Real time PCR

انتخاب مناسب کیت استخراج DNA

انتخاب مناسب کیت استخراج DNA

مقدمه

اگر شما قصد استفاده از DNA خالص شده در آزمایشگاه را دارید، به احتمال زیاد از کیت های تجاری استخراج DNA استفاده خواهید کرد. کیت های متفاوت زیادی در بازار موجود است و اینکه اگر بخواهید برای یک نمونه خاص یک کیت مناسب انتخاب کنید این کار می تواند یک چالش بزرگ باشد. در این مقاله من سعی می کنم به مرور نکاتی که برای انتخاب یک کیت استخراج DNA ضروری است بپردازم. با من همراه باشید.

آشنایی با کیت استخراج DNA

چه چیزی در کیت استخراج DNA وجود دارد؟

اکثر کیتهای استخراج DNA این روزها از مراحل مشابهی استفاده می کنند: لیز (شکست یا تخریب) سلولی، استخراج در ستون، شستشوی ناخالصی ها، خالص سازی از ستون. البته تفاوت هایی در هماهنگی مراحل در کیت های مختلف وجود دارد.

چه نمونه هایی را شما می توانید با این کیت ها کار کنید؟

کیت های مختلفی برای نمونه های گرفته شده از منابع گوناگون وجود دارد. از سلول های کشت داده شده در آزمایشگاه، نمونه های کلینیکی و نمونه های خاک گرفته تا نمونه های انگشت نگاری DNA. بسیاری از کیت ها برای عمل خاصی طراحی شده اند. برای مثال ، آیا می دانستید که هیومیک اسید خاک یا هموگلوبین خون می توانند برای DNA استخراج شده مهار کننده باشند و در فرآیندهای بعدی مانند PCR خلل ایجاد کنند؟

خوشبختانه، کیتهایی برای رفع این مشکل وجود دارند که در حین تخلیص DNA این مهارکننده ها را حذف می کنند. در مواقعی هم ممکن است شما بخواهید DNA خود را از محصول PCR یا ژل آگاروز تخلیص کنید، برای این موارد هم کیت های مختلفی وجود دارد.

تفاوت کیت استخراج DNA ژنومیک و پلازمید

در کل، استخراج DNA پلازمید باید ملایمتر از DNA ژنومی باشد. به این خاطر که مرحله لیز سلولی باید به گونه ای باشد که DNA ژنومی بتواند به پروتئین های سلولی متصل بماند تا در نهایت منجر به آلودگی DNA نشود.

کیت استخراج DNA سلول یا ارگانیسم

مشخصا مهمترین عامل در انتخاب کیت استخراج DNA مربوط به ارگانیسمی است که شما با آن کار می کنید.

  • باکتری: تعداد زیادی کیت با اجزاء گوناگون برای استخراج DNA باکتری موجود می باشند. مهمترین تفاوت در این کیت ها در این است که چگونه سلول را لیز می کنند. چراکه در برخی باکتریها با سختی بیشتری این کار انجام می شود. برای مثال باکتری هایی که به صورت بیوفیلم هستند نیاز یه تکنیک های لیز شدیدتری نسبت به روش های سنتی که بر اساس شوینده ها هستند دارند.
  • بافت: کیت هایی که برای استخراج DNA از یافت استفاده می شوند بافر لیز ملایمتری نسبت به باکتری دارند زیرا دیگر نیاز به شکستن دیواره سلولی ندارند. نکته ای که در استخراج DNA از بافت همیشه وجود دارد و یک چالش محسوب می شود انتخاب روش مناسب برای هوموژنیزه کردن است. علاوه بر این، در بسیاری از کیت هایی که برای استخراج DNA از بافت استفاده می شود به منظور کاهش ریسک آسیب به DNA در مرحله رسوب دهی، از فنول – کلروفرم استفاده نمی شود.
  • گیاه: هنگامی که از استخراج DNA در گیاه صحبت می کنیم باید موارد دیگری را مد نظر قرار دهیم. گیاهان معمولا دارای قندهایی هستند که در طول فرآیند تخلیص با دیگر کیتها جدا نمی شوند. لذا، دترجنها یا شوینده هایی که به صورت انتخابی به DNA وصل می شوند و محلول را رسوب می دهند، باید در ابتدا در محلول بسیار غلیط نمکی حل شوند و سپس پس از آن استخراج DNA را انجام دهند. روش های گوناگونی برای خارج کردن آلودگی ها از سلول های گیاهی وجود دارد که می توان به آنها مراجعه نمود.
  • خون: باید از پیشرفت های تکنولوژی تشکر نمود، زیرا تکنیک های لیز و استخراج متفاوتی در کیت ها برای استخراج DNA استفاده می شود. در واقع کاری که شما بعد از استخراج DNA از خون می خواهید انجام دهید این متدها را تعیین می کند. بر اساس کاربرد ، کیتی را انتخاب کنید که به شما یک DNA خالص، دو رشته و غلیظ بدهد.

شما چقدر DNA لازم دارید؟

بسیاری از شرکت ها که کیت های استخراج DNA را ارائه می دهند، کیتهایی با ترکیبات یکسان دارند که بر حسب حجم نمونه شما به مدل های مختلف تقسیم می شوند. مثلا، کیتهای استخراج DNA از باکتری وجود دارد که بر اساس حجم نمونه باکتری E. coli تهیه شده اند.

  • Miniprep: >15 mL
  • Midiprep: 15-25 mL
  • Maxiprep: 100-200 mL
  • Megaprep: 500-2,500 mL
  • Gigaprep: A whopping 2.5-5 L!

برای کاربردهای اختصاصی، هنگامی که صحبت از حجم و نمونه بافت باشد، انتخاب های کمتری وجود دارد که باید برای این منظور از کمپانی های مختلف استعلام کنید.

زمان شما بسیار با ارزش است: در استفاده از کیت استخراج DNA توان را در نظر بگیرید

هنگامی که شما بیش از 50 نمونه را باید بررسی کنید، استفاده از کیت های Miniprep ستونی منطقی نیست. کیت های با توان بالا را در نظر داشته باشیدکه می تواند با فرمت 96 خانه اجرا شود و کل نمونه ها را یکباره پردازش کند.

خوب بعد از مطالعه این مقاله متوجه شدیم که کیتها در اندازه ها و اشکال مختلف وجود دارند. چیزی که واضح است این موضع است که نتیجه حاصل از کیتی که شما استفاده می کنید باید یک DNA تمیز و غلیظ باشد. شما باید کمیت و کیفیت DNA استخراج شده را ارزیابی کنید تا مطمئن شوید کیتی که برای کارتان تهیه کردین مناسب است. اگر مشکلی در استفاده از کیت داشتید حتما با تولید کننده یا شرکت پشتیبان موضوع را مطرح کنید.

منبع: bitesizebio

این مقاله توسط New England biolabs  تهیه شده است

از چه کیتی در آزمایشگاه خودتان استفاده می کنید؟ آیا تا به حال از نمونه خاصی DNA استخراج کرده اید؟ خوشحال می شویم در قسمت کامنت در مورد تجربیاتتان برای ما بنویسید.

دسته‌هاPCR & Real time PCR

5 روش معمول برای تخلیص DNA

5 روش معمول برای تخلیص DNA

 

یکی از رایج ترین اموری که در زیست شناسی مولکولی انجام می شود تخلیص DNA است. ما DNA را از محلول های آبی تخلیص می کنیم تا بتوانیم آن را از نمک های بافر، آنزیم ها یا دیگر مواد موجود که بر روی فرایندهای بعدی تاثیر می گذارند جدا کنیم. از کاربردهای این روشها می توان به خالص سازی واکنش PCR ، خالص سازی بعد از برش آنزیمی با آنزیم های محدودالاثر و خالص سازی DNA ژنومی یا پلازمید از پروتئین ها و مواد زائد سلولی اشاره نمود.

به صورت معمول 5 روش برای این کار وجود دارد که در این مقاله به آنها اشاره می کنیم.

1- تخلیص DNA به وسیله فنول کلروفرم

استخراج به وسیله فنول –کلروفرم (این مقاله را بخوانید Kirby, 1957) معمولا بعد از فرآیند ته نشین سازی از طریق اتانول انجام می شود و یک راه سنتی برای حذف پروتئین های نمونه DNA می باشد. در این فرآیند، محلول DNA با کلروفرم و فنول ترکیب می شود. DNA محلول در آب در فاز آبی جدا می شود و پروتئین ها در فاز آلی حلال دناتوره می شوند و در آن می مانند. فاز آلی دارای پروتئین های عاری از DNA است که بعدا می توان آنها را جمع آوری نمود.

مزایا: راه ساده و ارزان برای جداسازی پروتئین ها از محلول های DNA

معایب: نسبت به روش های جدید زمان بیشتری نیاز دارد. امکان ماندن کلوروفرم و فنل در نمونه نهایی وجود دارد (می تواند واکنش های آنزیمی بعدی را تحت تاثیر قرار دهد). کلروفم و فنول هردو برای سلامت انسان مضر هستند.

 

2- تخلیص DNA به روش ته نشین سازی بوسیله اتانول

ته نشین سازی بوسیله اتانول روشی رایج برای نمک زدایی و تغلیظ DNA می باشد. کاتیون های تک ظرفیتی ( به میزان 0.1  الی 0.5 مولار معمولا به صورت نمک استات سدیم مصرف می شوند) همراه با اتانول 70% به DNA اضافه می شود.

اتانول ساختار DNA را تغییر می دهد و بنابراین باعث می شود تا مولکول DNA تجمع پیدا کند و در محلول ته نشین شود. (  Eickbush and Moudrianakis, 1978را ببینید). اکثر نمک ها و مولکول های آلی کوچک در اتانول 70% محلول هستند. DNA را می توان بوسیله سانتریفیوژ جداسازی کرد.

مزایا: روشی آسان و ارزان برای نمک زدایی DNA

معایب: زمانگیر می باشد، ریسک وجود اتانول در نمونه نهایی وجود دارد

 

3- تخلیص DNA با کمک کیت های ستونی

این کیت ها یک روش رایج برای تخلیص DNA هستند. اساس کار آنها هم به این شکل است که نمک های کاتروپیک جهت دناتوره کردن DNA (بوسیله باز کردن پیوندهای هیدروژنی) به نمونه اضافه می شود. در این شرایط DNA می تواند به صورت انتخابی به رزین های سیلیکای موجود در ستون اضافه شود. این کار جداسازی آن را از دیگر اجزاء موجود در نمونه راحت تر می سازد. پس از شستشو، DNA بوسیله محلول الوت با میزان نمک پایین جمع آوری می شود. محلول الوت به نوسازی (renaturing) DNA کمک می کند و باعث جداسازی آن از سیلیکا می شود. اکثر کیت های تجاری بر این اساس کار می کنند. طیف وسیعی از کیت های تخلیص بعد از استخراج از ژل آگاروز، واکنش های آنزیمی و PCR استفاده می شوند.

مزایا: به طور معمول استفاده می شود، سریع است، کاربر تعداد زیادی نمونه را می تواند با گزینه خلاء انجام دهد

معایب: ممکن است هزینه بر باشد. برخی از کیت ها بازده پایینی دارند (کمتر از 25%). استفاده از نمک های کاتروپیک می تواند مشکل ساز باشد.

نکته: برخی از عرضه کنندگان این کیتها کیتهای پیشرفته تری را ارائه می دهند که با استفاده از آنها در میزان کم الوت می توان DNA با غلظت بالاتری داشت.

 

4- تخلیص بوسیله تبادل آنیون (anion exchange)

روشهای خالص سازی مبتنی بر تبادل آنیونی DNA معمولا از رزینهای DEDE دارای بار مثبت استفاده می کنند که به فسفات DNA که دارای  بار منفی است متصل می شوند. با استفاده از نمک های خاص و شرایط مختلف  pH مولکول DNA به رزین متصل می شود و با یک مرحله شستشوی سخت آلودگی ها (پروتئینها و باقی مانده های سلولی) از محیط خارج می شوند. نهایتا DNA باقی مانده را می توان به صورت انتخابی از رزین الوت نمود.

مزایا: DNA با خلوص بالا که مناسب فرایند های پایین دست (Downstream) مانند سکانس DNA و ترنسفکشن

معایب: رزین ها گران قیمت هستند

 

5- تخلیص با کمک دانه های مغناطیسی (Magnetic beads)

در این مورد رشته های DNA با کنترل pH به دانه های مغناطیسی متصل می شوند. تعداد کمی کیت با تکنیک دانه های مغناطیسی در دنیا تولید می شود. دانه های مغناطیسی دارای بار مثبت هستند و در pH پایین به DNA متصل می شوند، اما در pH بالا دارای بار منفی می شوند و DNA را رها می کنند.

مزایا: سریع ، عدم استفاده از نمک های کاتروپیک و محلول های آلی شستشو. گزینه مناسب برای فرآیندهای اتوماتیک با توان بالا به این دلیل که دیگر نیازی به انجام سانتریفیوژ و دیگر مراحل وقت گیر نیست.

نکته اینکه دانه های مغناطیسی دیگری نیز وجود دارند که بر اساس غلظت نمک به DNA متصل می شوند.

معایب: قیمت خرید اولیه این کیت ها بالا می باشد. زمانی این فرایند مشکل دار می شود که شما آن را برای نمونه های گوناگون استفاده کنید، البته این موضوع در استفاده از دستگاه های اتوماتیک دیده نمی شود.

منبع: Bitesizebio

 

دسته‌هاPCR & Real time PCR

مهار کننده های PCR

 

معمولا، برای شما هم پیش آمده که هر کاری را برای یک PCR انجام داده باشید ولی با اینکه به بهترین شکل DNA خود را استخراج کرده اید، از تیوب ها و سرسمپلرهای استریل و مواد تمیز استفاده کرده اید، اما یک چیز نا معلومی نتایج PCR شما را خراب کرده باشد. این موارد نا معلوم مهار کننده های PCR (PCR inhibitors) هستند.

قبل از اینکه این موضوع را به قانون مورفی مربوط کنید آزمایش خود را مجدد انجام دهید. اجازه بدهید مشخص شود که مهارکننده های PCR چرا اینقدر اذیت می کنند و ما چه کاری می توانیم برای جلوگیری از آنها انجام بدیم.

مهار کننده های PCR چه هستند؟

مهار کننده های PCR از تکثیر نوکلئیک اسیدها جلوگیری می کنند ومنجر به ایجاد جوابهای اشتباه، کاهش حساسیت یا از بین رفتن PCR می شوند. مهار کننده ها به نوکلیئک اسیدها و پلیمرازها متصل می شوند و در همانندسازی DNA  اختلال ایجاد می کنند یا به کوفاکتورهای اصلی مانند Mg+2 متصل شده و از دسترسی آنزیمها به آنها جلوگیری می کنند.  مهار کننده ها حتی می توانند اتصال پرایمرها به DNA را مختل کنند.

مهار کننده های PCR از کجا می آیند؟

مهار کننده ها در نمونه ها : بافت (برای مثال کلاژن)، خون ( برای مثال هپارین، هموگلوبین، ایمونوگلوبولین ها، پروتئازها، نوکلئازها)، مدفوع (نمک هایی صفرا، اوره) ، محیط کشت سلولی و در مواد گیاهی( برای مثال: کلوروفیل).نها جلوگیری می کنند. حییی

مهار کننده ها در آماده سازی نمونه: مواد شیمیایی موجود در فرایند استخراج و آماده سازی نمونه شامل: (برای مثال: KCl، NaCl، دترجنت هایی مانند SDS،  Triton X100، Tween20، Xylene) ، نوکلئازهایی با منشاء خودتان

مهار کننده ها در خالص سازی نوکلئیک اسیدها: مواد خاصی که برای خالص سازی استفاده می شود اگر در ادامه واکنش حذف نشود و یا در غلظت خاصی باقی بماند می تواند برای PCR مهار کننده باشد (برای مثال: اتانول، ایزوپروپانول، فنول و سدیم استات).

در هنگام خالص سازی این مواد جا می مانند و با نوکلئیک اسید خالص سازی می شوند. EDTA در بافر TE، که به طور معمول برای نگهداری DNA استفاده می شود می تواند با به دام انداختم یون های Mg+2 منجر به مهار PCR شود.

مهار کننده ها در مصرفی های آلوده: پودر موجود بر روی دستکش ها، نوکلئاز های موجود در تیوب ها و نوک سمپلرها

حقیقت خنده دار: امونوگلوبولین های طبیعی (IgG) موجود در خون یکی از قویترین مهارکننده های PCR هستند زیرا تمایل شدیدی به اتصال به مولکول DNA تک رشته ای دارند. این خاصیت مهار کنندگی را می توان با انکوبه کردن نمونه با DNA های غیر اختصاصی خنثی نمود تا IgG غیر فعال شود.

 

 

چطور می توان مهار کننده های PCR را تشخیص داد؟

برای یافتن مشکل، در هر مرحله از فرآیند و خالص سازی کنترل قرار دهید تا مشخص شود کدام مرحله آلودگی به مهار کننده دارد و PCR را دچار اختلال می کند. همچنین قسمت کوچکی از نمونه های خود را در هر مرحله نگه دارید. این موضوع به شما کمک می کند که در صورت نیاز به مرحله قبل برگردید و مشخص کنید که ایراد از کجا بوده است.

  • کنترل مثبت های داخلی (تیوب های مشابه) را با کنترل مثبت های خارجی (تیوب های متفاوت) مقایسه کنید . تکثیر را بین نمونه تست و واکنش های کنترل که به صورت موازی انجام شده اند مقایسه کنید. این کنترل های مثبت، کنترل های عالی برای هر متغیر در واکنش PCR هستند که می تواند شامل خود تیوب که با تیوب کنترل مشابه است شود.
  • می توانید از اسپکتروفتومتری برای بررسی حضور مهارکننده ها استفاده کنید. جذب A260/280 نزدیک به 2 مربوط به RNA و 1.8 مربوط به DNA می باشد. ( اندازه پایینتر نشان دهنده وجود آلودگی فنول یا پروتئین می باشد). جذب A260/230 برای RNA باید نزدیک به 2.2 باشد و برای DNA باید 2 باشد (اندازه کمتر به معنی کربوهیدرات، گوانیدین، فنول یا آلودگی گلیکوژن است).
  • در موارد بسیار حساس و نامعلوم می توانید از آنالیزهای HPLC یا MS استفاده کنید

چه کاری انجام دهم تا از مهار کننده های PCR جلوگیری کنم؟

  • در شرایط تمیز کارکنید، از نوک سمپلرهای تمیز و تیوب های تمیز استفاده کنید.
  • از پوشش های محافط مانند دستکش، روپوش و ماسک استفاده کنید تا آلودگی نوکلئازی کاربر پیدا نشود.
  • از روش های استاندارد برای تهیه نمونه استفاده کنید ، اگر در روشی که استفاده می کنید نمونه ها تمیز نیستند روشتان را تغییر دهید.
  • از روشهای کامل برای خالص سازی استفاده کنید (برای مثال روش استخراج با گوانیدیوم ایزوتیوسیانات برای یک سری نمونه ها بهتر جواب می دهد، روش استخراج با فنول کلوروفرم برای نمونه هایی که آلودگی لیپیدی دارند بهتر پاسخگو است. دقت کنید از فنل زیاد استفاده نشود زیرا فنول خودش مهارکننده ی PCR است)
  • از کربن فعال، ستون های سیلیکا، رزین های تبادلی کاتیونی، دانه های سیلیکای مغناطیسی یا روش های گرفتن ایمونولوژیک (Immunocapture) جهت حذف آنتی ژن های مهارکننده استفاده کنید. در پزشکی قانونی که آلودگی نمونه ها همیشه یک مساله است از چلکس (chelex) برای خالص سازی DNA استفاده می شود.
  • از کیت های تجاری استفاده کنید که می توانند مهارکننده ها را از محیط خارج کنند.
  • از آنزیم تک پلیمراز نوترکیب استفاده کنید که قدرت بالاتری دارد و به مهارکننده ها مقاومت بیشتری دارد.
  • DNA را به جای TE در آب نگهداری کنید. برای جلوگیری از خرد شدن DNA آن را در حجم های کوچک الیکوت (تقسیم) کنید.
  • از افزودنی ها یا تسهیل کننده ها استفاده کنید (برای مثال، بتائین، BSA، DMSO، فرمامید، گلیسرول، PEG، پودر شیر، مهارکننده های پروتئاز، مهارکننده های نوکلئاز). انتخاب افزودنی ها به نمونه ای که می خواهید مهار شود بستگی دارد.
  • PCR خود را به اندازه های کوچکتر الیکوت کنید تا غلظت مهارکننده کم شود. البته این کار می تواند باعث کاهش حساسیت PCR شود و تشخیص نمونه هدف مشکلتر می شود.

مهار کردن مهارکننده های خاص:

حذف فنول: از polyvinylpyrrolidone استفاده کنید

حذف پلی ساکاریدها: از  Tween-20, DMSO, PEGو کربن فعال استفاده کنید

حذف هیومیک اسید (در نمونه های ادرار بسیار دیده می شوند): دیالز، فلوکولاسیون، روشهایی که بر اساس ستون هستند، اولترافیلتراسیون

حذف پروتئاز ها: مهار کننده  های پروتئاز، BSA

حذف Ca2+ : افزودن Mg2+ یا دیگر عوامل چلاه کننده

این مقاله یک بررسی اجمالیست در خصوص مهارکننده های PCR و راه های مقابله با آنها. اگر شما هم از جمله افرادی هستید که با یک PCR مهارشده مواجه هستید، بر روی PCR خود یک آنالیز انجام دهید تا بتوانید مهارکننده PCR خود و تاثیر آن را پیدا کنید. بعد از آن روش مقابله با آن را بررسی کنید. در این مقاله ما تعدادی از مهار کننده ها را خدمتتان معرفی کرده ایم و در زیر نیز چند رفرنس برای اطلاعات بیشتر قرار می دهیم، امیدواریم که برای کار شما مفید باشد.

برای مطالعه بیشتر:

  1. Thermo Scientific technical bulletin T123 Rev 1/2012 https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/T123-NanoDrop-Lite-Interpretation-of-Nucleic-Acid-260-280-Ratios.pdf accessed 2017-05-28.
  2. Schrader C et al. (2012) PCR inhibitors – occurrence, properties, and removal. J Appl Microbiol 113(5):1014-26.
  3. Abu Al-Soud W et al. (2000) Effects of amplification facilitators on diagnostic PCR in the presence of blood, feces, and meat. J Clin Microbiol 38(12):4463-70.
  4. van Pelt-Verkuil et al, Principles and technical aspects of PCR amplification. Springer 2008, ISBN 978-1-4020-6240-7
  5. www.bitesizebio.com

دسته‌هاPCR & Real time PCR

8 نکته ضروری در الکتروفورز DNA

8 نکته ضروری در الکتروفورز DNA

انتخاب محصولات و روش های مناسب جهت انجام الکتروفورز برای آنالیز اسید نوکلئیک در موفقیت آزمایش ضروری است. این نکات به بهبود نتایج الکتروفورز و آنالیز رایج DNA و RNA بسیار کمک می کند. در این مقاله می خواهیم نکات جالب و مهمی را ارائه دهیم. امیداریم که این نکات برای شما مفید باشد.

 

نکته 1: انتخاب لدر مناسب برای مشخص کردن محصولات PCR یا ژل های با بازده بالا

لدرهای مناسب آنهایی هستند که دارای باندهای کمتری هستند. لدرهایی را انتخاب کنید که باندها در آنها سریع جدا می شوند و حرکت سریعتری دارند.

نکته 2: انتخاب غلظت بهینه ژل آگارز

غلظت آگارز تاثیر بسزایی بر روی کیفیت جداسازی نمونه ها یا لدر بر روی ژل دارد. هرچه طول DNA  بلندتر باشد به آگارزی با غلظت پایینتر احتیاج است.

جدول ذیل را مشاهده نمایید

جدول: غلظت آگارز بر کیفیت جداسازی تاثیر می گذارد

غلظت آگارز ( %) بازه طولی جداسازی کامل
0.5 2000 الی 50000 جفت باز
0.6 1000 الی 20000 جفت باز
0.7 800 الی 12000 جفت باز
0.8 800 الی 10000 جفت باز
0.9 600 الی 10000 جفت باز
1 400 الی 8000 جفت باز
1.2 300 الی 7000 جفت باز
1.5 200 الی 3000 جفت باز
2 100 الی 2000 جفت باز
3 25 الی 1000 جفت باز
4 10 الی 500 جفت باز
5 10 الی 300 جفت باز

 

شکل 2: A) غلظت آگارز می تواند بر شقاقیت لدر های DNA تاثیر بذارد. B) شفافیت باندها در زمانی که غلظت آگارز به خوبی بر اساس سایز قطعات DNA انتخاب شده باشد بهبود میابد.

 

نکته 3: از TBE استفاده کنیم یا TAE؟

 

TAE

  • معمولا برای قطعات بلند استفاده می گردد
  • با واکنش های آنزیمی سازگاری دارد
  • برای درست کردن ژل الکتروفورز پیشنهاد می شود

 

TBE

به صورت معمول برای جداسازی قطعات کوچک DNA استفاده می شود.

 

شکل 3: انتخاب رانینگ  بافر (بافر الکتروفورز) مناسب. قطعات نوکلئیک اسید به میزان 10 درصد کندتر در بافر TBE حرکت می کنند.

 

برای آشنایی با افزودنی های PCR روی تصویر کلیک کنید

pcr

نکته 4: انتخاب بافر بارگذاری مناسب برای نمونه

بافر بارگذاری (Loading buffer) نمونه برای 2 هدف استفاده می شود:

  • رنگ مرئی را فراهم می کند که کاربر می تواند به کمک آن نمونه را در هنگام بارگذاری در چاهک ها ببیند همچنین نشان می دهد که چه میزان ژل ران شده است.
  • این بافر دارای غلظت بالایی از گلیسرول یا سوکروز می باشد که باعث سنگین شدن نمونه شده و کمک می کند که نمونه در انتهای چاهک ها قرار بگیرند و در بافر الکتروفورز پخش نشوند.

هنگامی که می خواهید از بافر رانینگ استفاده کنید مطمئن شوید که از یک بافر هم برای نمونه و هم برای لدر استفاده می کنید. از پوشاندن باند های خود بوسیله رنگ های موجود در بافر بارگذاری جلوگیری نمایید. برای مثال، بافر 6X لودینگ DNA دارای رنگ Orange G است ( مشابه DNA با طول 50bp حرکت می کند) و Xylene cyanol ( مشابه DNA با طول 4000 bp حرکت می کند) . بنابراین زمانی که این بافر بارگذاری مناسب قطعات کوچک است باندهایی با طول تقریبا 50bp ممکن است بوسیله رنگ Orang G پوشانده شده و نشان داده نشوند.

 

شکل 4: انتخاب بهترین بافر لودینگ برای الکتروفورز ژل

 

نکته 5: انتخاب نمونه های گزینشی برای الکتروفورز

  • بارگذاری مقدار زیاد DNA می تواند بر روی حرکت نمونه بر روی ژل تاثیرگذار باشد. حجم زیاد قطعات DNA بر روی ژل به آهستگی حرکت می کند و در نتیجه از چیزی که به واقع است بزرگتر نشان داده می شود.
  • DNA های بسیار کوچک به سختی بر روی ژل تشخیص داده می شوند. مشخصا باندهای های کوچکتر بیرنگ تر هستند.

مطمئن شوید که میزان DNA بارگذاری شده بر روی ژل حداقل 20ng به ازای هر باند باشد. این در صورتی است که ژل را به وسیله اتیدیوم بروماید (EtBr) یا سایبر سیف (SYBR Safe) رنگ می کنید. سایبر گلد بسیار حساستر از این دو رنگ است و اگر از آن استفاده می کنید DNA در هر چاهک باید حد اقل 1ng به ازای هر باند باشد.

 

شکل 5: تاثیر غلظت نمونه بر الگوی حرکت

 

 

نکته 6: انتخاب اندازه ژل بهینه

 

  • برای ژل های کوچک : ژل های 8 در 10 سانتیمتر (مینی ژل) به صورت معمول استفاده می شود. حجم آگارز برای مینی ژل ها معمولا 30 الی 50 میلی لیتر است.
  • برای ژل های بزرگ : این ژل ها معمولا برای ساترن و نورترن بلات استفاده می شوند. حجم محلول آگارز برای این ژل ها باید به اندازه 250 میلی لیتر باشد.

 

نکته 7: جلوگیری از اثر “لبخند”

دلایل اصلی اثر لبخند شامل موارد ذیل هستند:

  • حرارت دادن ناجور ژل در نقاط مختلف. این موضوع زمانی پیش می آید که ولتاژ بالا باشد. برای جلوگیری از این قضیه کاربر می تواند ژل را آهسته ران کند (ولتاژ را کم کند). بعد از این کار دما نیز درون تانک کاهش پیدا می کند.
  • توزیع ناجور میدان الکتریکی در عرض ژل. این موضوع می تواند با چک کردن تنظیمات تانک برای اتصالات ضعیف یا دیگر مشکلات ساختاری دستگاه باشد.

 

شکل 6: اثر ” لبخند” را نشان می دهد

 

نکته 8: اهمیت غوطه ور سازی ژل درون بافر الکتروفورز (Running buffer)

یک ژل باید به صورت کامل درون بافر الکتروفورز غوطه ور شده باشد و به اندازه 3 الی 5 میلیمتر بالای ژل را بافر بپوشاند.

بافر ناکافی می تواند منجر به شفافیت پایین ژل ها، خراب شدن باند و حتی ذوب شدگی ژل شود. بالا بودن میزان بافر هم می تواند منجر به کاهش حرکت DNA و خراب شدن باند گردد.

 

شکل7: حجم بافر الکتروفورز می تواند بر روی حرکت DNA و شفافیت باندها تاثیرگذار باشد

 

به پایان مقاله 8 نکته ضروری در الکتروفورز DNA می رسیم، ممنون که با ما همراه بودید، این مقاله از جمله مفیدترین مقالاتی است که در مورد الکتروفورز ژل آگاروز و لدر DNA نوشته شده است. برای مشاهده اصل مقاله به زبان انگلیسی می توانید اینجا کلیک کنید.