pcr troubleshooting

چگونه از یک PCR سخت، جان سالم به در ببریم

مطمئنا خیلی از شماها هم با این مساله روبرو بوده اید. همه چیز به خوبی و راحتی جلو می رود و پروژه تمام و کمال در حال انجام است تا اینکه این PCR…

به دلایلی، کار نمی کند. در عکس های ما سیاهی دیده می شود. حتی با اینکه من یک ذهن علمی دارم بعض وقتی ها به معجزه و جادو فکر می کنم.

خوب جادوگران علمی با چه دلیل و منطقی یک PCR کار نمی کند؟

بسیار خسته کننده است که زمان و انرژی زیادی را صرف انجام یک  PCR کنیم و بعد که ژل آگارز را چک می کنیم هیچ باندی نبینیم یا یک اسمیر ضعیف و با تعداد زیادی باند غیر اختصاصی  ببینیم. در این مقاله من به شما جواب هایی را خواهم داد که می تواند تمام مشکلات شما را حل کند، یا حداقل مشکلات PCR شما را حل کند.

 

اولین چیز.. ابتدا به نمونه خود نگاهی بیاندازید

نگاه خوب و دقیق به نمونه خود بیاندازید. آیا دارای درصد GC بالا می باشد (بالای 65 درصد)؟ اگر اینطور است، بدانید که نمونه های دارای درصد بالای GC سخت تر تکثیر می شوند و مشکلتر باز می شوند. به منظور تکثیر آنها شما باید دمای annealing را بالا برده، و یا از DMSO و دیگر ناپایدار کننده های ساختار دوم به منظور اطمینان از تکثیر نمونه دارای درصد بالای GC استفاده نمایید.

طراحی پرایمر

طراحی پرایمر به شدت مهم می باشد. در اینجا چند تا از نکته هایی که در هنگام طراحی پرایمر باید به خاطر سپرد را می آوریم.

  • طول پرایمر: پرایمرها باید بین 18 الی 22 نوکلئوتید باشند. در این صورت به اندازه کافی طول دارند تا اختصاصی عمل کنند ( کاهش اتصال به توالی های غیر اختصاصی) و همچنین اندازه ای است که به الگوی مد نظر متصل شود.

  • ساختار دوم: ساختار دوم علاوه بر متصل شدن پرایمرها به DNA الگو پرایمر ها را مشغول خودشان نگه می دارد. خوشبختانه ابزارهای بیوانفورماتیکی زیادی وجود دارد که ساختار دوم پرایمر را پیشبینی می کند. از جمله Oligo Analyzer 3.1 و GeneRunner.

  • دمای ذوب (Melting temperature) و دمای اتصال (annealing temperature): دمای ذوب (Tm) با توجه به نسبت AT:CG پرایمرهای شما محاسبه می گردد و توسط تامین کننده پرایمر تهیه می گردد. به منظور انجام PCR نیاز است که دو رشته پرایمر به تک رشته تبدیل شوند. تا به رشته های DNA متصل شوند. این موضوع در هنگام حرارت دادن واکنش شما تا دمای ذوب مناسب به دست می آید. پرایمرهایی با دمای اتصال  بین 52 الی 58 درجه معمولا بهترین نتایج را ایجاد می کنند. دمای Annealing دمایی است که در آن پرایمر تک رشته ای به DNA تک رشته ای متصل می گردد. اگر این دما زیاد بالا باشد، فرآیند اتصال پرایمر موفقیت آمیز نخواهد بود و منجر به محصول PCR کم خواهد شد. اگر هم خیلی کم باشد منجر به هیبریدیزاسیون غیر اختصاصی و تشکیل محصولات غیر اختصاصی در PCR می گردد.

  • ویژگی:   این خیلی مهم است. اگر پرایمرهای شما اختصاصیت ندارند، هرگز نمی توانید از هویت محصول PCR خود اطمینان داشته باشید. مطمئن شوید که پرایمر شما فقط با توالی هدف شما هماهنگ خواهد شد ، و نه توالی دیگری. (برای مثال سدوژن های در DNA الگوی شما). همیشه پیش از سفارش پرایمر باید توالی آن را در مقابل توالی ژنوم مرجع Blast نمایید تا مشکلات ویژگی را به حد اقل برسانید.

  • این موضوع هم بسیار مهم است که از عدم اتصال پرایمر خود به دیگر پلیمرف های شناخته شده یا موتاسیون ها مطمئن شوید. فراموش نکنید که ممکن است در اثر عدم اتصال پرایمر به یک آلل، Allele dropout اتفاق بیافتد. که این موضوع می تواند منجر به از دست دادن اطلاعات ارزشمند گردد. به نظر ترسناک است اما ابزار های بیوانفورماتیکی زیادی وجود دارند که شما را در طراحی یک پرایمر کامل کمک می کنند.

ملاحظات DNA الگو

باید در نظر داشت که مشکلات PCR شما می تواند کلا پیش از انجام PCR باشد. ممکن است نمونه DNA شما دارای بازدارنده های PCR باشد. بازدارنده ها در انواع نمونه های بیولوژیک (خون ، اندام ها و غیره..) ، نمونه های محیط پیرامون و حتی در هنگام استخراج نوکلئیک اسیدها دیده می شوند.

فراموش نکنید: نمونه DNA باید تا جایی که امکان دارد دست نخورده باشد تا PCR به خوبی کار کند. گاها ممکن است تخریب هایی در DNA ایجاد شود ولی تا زمانی که نمونه هدف دست نخورده ای داشته باشید همه چیز خوب خواهد بود.

پیشنهاد می شود که کمیت ، خلوص و میزان قطعه قطعه شدن DNA خود را قبل از PCR بررسی نمایید. اگر DNA شما بسیار قطعه قطعه شده بود، باید PCR را مجددا برای قطعات کوتاه تر طراحی نمایید یا روش استخراج  DNAخود را تغییر دهید.

اگر شما با تکثیر DNA مشکل دارید و به DNA الگوی خود شک دارید پیشنهاد می کنم PCR خود را به صورت دو تکرار انجام دهید. یک واکنش باید دارای DNA مورد نظر باشد و یک واکنش دارای یک DNA که قبلا به خوبی کار کرده و جوابگو بوده باشد. فراموش نکنید که هیچ تغییر دیگری نباید بین این دو واکنش ایجاد شود.

کنترل های منفی و مثبت

به یاد داشته باشید وجود کنترل منفی و مثبت در آزمایشات شما در هنگام بروز مشکلات برای رفع عیب (Troubleshooting) کمک کننده است. چه اتفاقی می افتد وقتی کنترل مثبت شما کار کند ولی نمونه شما کار نکند؟ خوب، ممکن است نمونه DNA خرد شده باشد، یا اینکه الیکوت نمونه کامل انجام نشده باشد. اگر کنترل منفی چیزی نشان دهد شما ممکن است در موادی که باآنها کار می کنید آلودگی داشته باشید.

اگراصلا هیچ واکنشی کار نکرد، گاهی اوقات لازم است تا از آزمایشگاه خارج شوید و به مراحل کار مجدد فکر کنید. از نکات ذکر شده دراین مقاله استفاده کنید و از تغییرات نترسید تا یک باند عالی در نتایج ژلتان ببینید. در هر آزمایش سعی کنید یک متغیر داشته باشید تا نتیجه حاصل شود. در این صورت از یک PCR سخت زنده بیرون می آیید.