10 افزودنی عالی به واکنش PCR

در این مقاله با 10 افزودنی عالی به واکنش PCR آشنا می شوید

افزودنی های PCR

PCR یک مبارزه بین تکثیر DNA هدف به میزان پایین در مقابل تکثیر بالای مناطق غیر اختصاصی است. اما شما می توانید این مبارزه را با استفاده از 10 افزودنی برتر PCR برنده شوید و همکارانتان را شگفت زده کنید. معمولا افزودنی های PCR از دو مکانیسم استفاده می کنند.  1) باعث کاهش ساختار دوم DNA می شوند و درنتیجه میزان تکثیر DNA را بالا می برند یا، 2) باعث کاهش اتصال پرایمر به محل های غیر اختصاصی می شوند و بنابراین باعث کاهش تکثیرهای غیر اصلی می گردد. متن ذیل که شمامل 10 افزودنی عالی به واکنش PCR است را مظالعه نمایید تا ببینید کدام افزودنی ها چه کاری انجام می دهند و چگونه برای شما می توانند مناسب باشند.

 

افزودنی های PCR که ساختار دوم را کاهش می دهند:

این افزودنی ها ساختار دوم را کاهش می دهند. با کاهش ساختار دوم DNA توسط این افزودنی ها، میزان تکثیر قطعه مورد نظر و بازده تکثیر محصولاتی که به سختی تکثیر می شوند افزایش میابد. مانند توالی های غنی از GC.

DMSO

DMSO

DMSO به منظور کاهش ساختار دوم DNA استفاده می شود. بنابراین، هنگامی که قطعه DNA دارای درصد بالای GC است کاربرد دارد. ولی DMSO توان Taq پیمراز را کاهش می دهد لذا باید یک تناسبی بین میزان DMSO و Taq پلیمراز ایجاد کرد. برای این کار، غلظت های مختلف DMSO از 2 تا 10 درصد حجم PCR را آزمایش کنید.

NP-40

 

شوینده های غیر یونی Non-ionic detergents

شوینده های غیر یونی از قبیل مقادیر 0.1 – 1 درصد از Triton X-100، Tween 20 و NP-40 نیز می توانند ساختار دوم را کاهش دهند. این افزودنی ها بازده PCR را بالا می برند ولی ممکن است باندهای غیر اختصاصی را افزایش دهند. بنابراین هنگامی که برای PCR های با بازده پایین استفاده می شوند باید احتیاط کرد که واکنش PCR آلوده نشود. از دیگر مزایای شوینده ها مقابله با آلودگی SDS است. SDS از آلوده کننده های واکنش PCR است که هنگام استخراج DNA همراه آن می آید که می تواند جلوی فعالیت Taq پلیمراز را بگیرد. استفاده از 0.5 درصد از Tween-20 یا Tween-40 می تواند اثرات منفی SDS را خنثی کند.

Betaine

بتائین

بتائین

بتائین نیز می تواند ساختار دوم DNA را کاهش دهد و تکثیر DNA را افزایش می دهد و یکی از افزودنی های جادویی است که در کیت های تجاری PCR استفاده می گردد. اگر می خواهید در واکنش های خود از این افزودنی استفاده کنید از بتائین یا بتائین مونو هیدرات استفاده کنید نه بتاین HCl. غلظت نهایی مناسب برای این ماده 1-1.7M است. بتائین همچنین می تواند با از بین بردن ساختارهای جفت بازی که روی ذوب DNA تاثیر می گزارند باعث افزایش اختصاصیت شود.

افزودنی هایی که اتصال های غیر اختصاصی پرایمر را کاهش می دهند

این افزودنی ها بوسیله کاهش اتصالات غیر اختصاصی پرایمر از تکثیر DNA غیر هدف جلوگیری می کنند و PCR را تمیز نگه می دارند.

Formamide

فرمامید

فرمامید

فرمامید در بین افزودنی های آلی PCR کهر از جمله 10 افزودنی عالی به واکنش PCR هستند، کاربرد بالایی دارد. فرمامید به حفره بزرگ و کوچک DNA متصل می شود و باعث ناپایدار سازی DNA و کاهش دمای ذوب آن می شود. این ماده معمولا به میزان 1 – 5% در PCR استفاده می شود.

TMAC

Tetramethyle ammonium chloride (TMAC) اگر در بازار پیدا شود می تواند اختصاصیت هیبریدزاسیون و دمای ذوب را بالا می برد. لذا TMAC باعث حذف اتصالات غیر اختصاصی پرایمر و اتصالات اشتباه DNA-RNA می شود. این ماده بیشتر در PCR هایی که از (Degenerate primer) استفاده می شود کاربرد دارد. این ماده معمولا در غلظت نهایی 15-100mM استفاده می شود.

 

دیگر افزودنی های رایج:

در ادامه تعداد دیگری از افزودنی های رایج PCR را خواهید دید که از روش های دیگری بر PCR اثر می گزارند.

منیزیم

منیزیم کوفاکتور مورد نیاز برای آنزیم Taq پلیمراز است. بدون منیزیم آزاد آنزیم Taq پلیمراز غیر فعال است. میزان بالای منیزیم نیز کیفیت کار Taq را کاهش می دهد. میزان منیزیم در PCR های مختلف متفاوت است. عوامل شلاته کننده (EDTA یا سیترات)، غلظت dNTP و پروتئینها همه می توانند بر غلظت منیزیم تاثیرگزار باشند. از نظر عملی اگر در PCR دچار مشکل شدید مقادیر منیزیم را تست کنید. برای این منظور غلظت های 1 – 4 میلی مول از Mg2+ را در فواصل 0.5 -1 میلی مولار تست کنید.

مهم: ذوب و فریز کردن محلول کلرید منیزیم می تواند گرادیان غلظت ایجاد کند بنابراین بسیار مهم است که قبل از استفاده در PCR آن را ورتکس کنید و خوب به هم بزنید.

BSA

Bovine serum albumin در بسیاری از فرایندهای مولکولی استفاده می شود که می توان به PCR و هضم آنزیمی اشاره نمود. در PCR این ماده می تواند با آلودگی های فنولی مقابله کند. همچنین BSA می تواند از اتصال اجزاء PCR به دیواره تیوب جلوگیری کند. BSA به میزان 0.8mg/ml در PCR استفاده می شود.

حرف آخر:

عوامل مختلفی در عملکرد PCR دخیل هستند و برای استفاده از هر افزودنی باید هر کدام را با توجه به شرایط PCR خودتان تست کنید.

 

پایان مقاله : ” 10 افزودنی برتر PCR” ، امیدوارم از این مقاله استفاده لازم را برده باشید.