پروتئیناز K

20 سوال در مورد پروتئیناز K

 

در این مقاله پاسخ به 20 سوال در مورد پروتئیناز k آورده شده است. هنگام استفاده از پروتئیناز K سوالات مختلفی ایجاد می شود. مثلا، چطور می شه پروتئیناز K را غیر فعال کرد، دمای نگهداری این آنزیم چند درجه است؟ پروتئیناز K چطور محلول می شه؟ و یک لیستی از سوالات… ما تصمیم داریم در اینجا تعدادی از مهمترین سوالات راجع به پروتئیناز K را مطرح کنیم تا منبع خوبی برای محققین باشد.

 

1- پروتئیناز K را چگونه غیر فعال کنیم؟

این سوال یکی از رایج ترین سوالات است، و پاسخ بسیار ساده ای دارد. گرما دادن از پر کاربرد ترین موارد در غیر فعال کردن پروتئیناز K است. فعالیت پروتئیناز K با دما افزایش پیدا می کند و در 65 درجه سانتیگراد به بالاترین میزان خودش می رسد . اما شما می توانید دما را تا 95 درجه سانتیگراد به مدت 10 دقیقه بالا ببرید تا آنزیم را غیرفعال کنید.

البته به یاد داشته باشید حتی بعد از این دما هم به میزان خیلی پایینی آنزیم فعالیت می کند. لذا مهارکننده های پروتئاز از قبیل PMSF و AEBSF می توانند برای همیشه آنزیم را غیرفعال کنند.

نکته اینکه در مورد دمای واقعی غیر فعال سازی پروتئیناز K  اتفاق نظر وجود ندارد ولی باید چیزی بین 70 الی 95 درجه باشد.

 

2- دمای بهینه فعال کردن پروتئیناز K چه دمایی است؟

همانطور که در مورد 1 توضیح داده شد، فعالیت پروتئیناز K با افزایش دما افزایش پیدا می کند (البته تا درجه خاصی). دمای بهینه برای فعالیت آنزیم بین 50 الی 60 درجه سانتیگراد است. دمای بلا به باز شدن پیچش های پروتئین های دیگر کمک میکند و بنابراین پروتئیناز K می تواند به راحتی پروتئینها را بشکند.

البته بهینه کردن دما مهمترین چیز در این فرآیند نیست. گاهی اوقات روشهای مخصوصی باید انجام شود تا نتیجه بالاترین بازده را داشته باشد. چیزی که باید به خاطر سپرد این است که هنگامی که دماهای مختلف به آنزیم داده می شود، پروتئیناز K همچنان در گستره دمایی بین 20 تا 65 درجه فعال است و این گستره وسیع می تواند برای بسیاری از روشهای مولکولی مهم باشد. در درمای بالای 65 درجه با افزایش دما ریسک غیر فعال شده آنزیم هم وجود داره.

 

3- چه ارتباطی بین کلسیم و پروتئیناز K است؟

اتصال پروتئیناز K به Ca2+ باعث پایداری آنزیم می شود. مخصوصا زمانی که آنزیم در معرض حرارت قرار می گیرد. کلسیم همچنین پروتئیناز K را در برابر اتولیز محافظت می کند. کلسیم به مقاومت دمایی پروتئیناز K کمک می کند ولی در فعالیت پروتئولیتیک نقشی ندارد.

بر طبق یافته های Richard Tullis and Harvey Rubin  این ارتباط زمانی جالب می شود که آنزیم DNase I هم دخیل باشد. پروتئیناز K به منظور غیر فعال کردن DNase و RNase استفاده می گردد ولی DNase I در حضور Ca2+ می تواند از پروتئیناز K محافظت گردد (در غلظت 1mg/ml). اما RNase در هر صورت غیرفعال می گردد. یافته های آنها روشی را برای DNaseI بدون RNase و یا استخراج RNA پلیمریزه شده ارائه نمود.

 

4- آیا EDTA پروتئیناز K را غیر فعال می کند؟

این سوال در زمانی که با پروتئیناز K کار می شود ایجاد می شود. شلاته کننده های مانند EDTA یا EGTA تاثیر مستقیمی بر روی فعالیت پروتئیناز K ندارند.

اغلب، استفاده از EDTA به همراه پروتئیناز K در هنگام خالص سازی DNA یا RNA برای حذف کلسیم از محیط است. اما از آنجایی که کلسیم برای پایداری پروتئیناز K اهمیت دارد، بنابراین حذف کلسیم از پایداری پروتئیناز K کم می کند.

 

5- فعال کننده های پروتئیناز K چه چیزهایی هستند؟

فعال کننده های پروتئیناز K شامل SDS یا (Sodium dodecyl sulfate) و اوره می شود. معمولا، پروتئیناز K در بافرهایی که دارای این مواد هستند بسیار پایدارتر و فعالتر است.

عمل پروتئیناز K

عمل پروتئیناز K

 

 

6- چگونه پروتئیناز K در لیز (هضم) سلولی شرکت می کند؟

در پاسخ به این سوال، باید دانست که ماهیت پروتئیناز K چیست. این آنزیم یک پروتئاز وسیع الطیف است که توانایی هضم انواع پروتئین را دارد. هنگامی که در لیز سلولی از این آنزیم استفاده می شود، بخصوص در استخراج و خالص سازی DNA، پروتئیناز K می تواند با هضم پروتئینهای سطحی جزئی از فرآیند باشد.

هنگامی که زمان محلول کردن مجدد و لیز شدن هسته در بافر حاوی پروتئیناز K می رسد ، پروتئیناز K به هضم پروتئین ها کمک می کند که در نهایت منجر به هضم نمونه می گردد.

7- چرا در بسیاری از پروتوکل های استخراج DNA بافر لیز دارای پروتئیناز K و RNase است؟

این سوال هر از چند گاهی مطرح می شود زیرا به نظر می رسد یک موضوع متناقض است. گفته می شود پروتئیناز K، آنزیم RNases را هضم می کند ، بنابراین چرا این دو با هم در یک بافر لیز (Lysis buffer) اضافه می شوند؟

اول از همه ، شما می خواهید RNase اضافه شود که از آلودگی RNA هنگام جداسازی DNA جلوگیری شود و همچنین می خواهید از پروتئیناز K استفاده کنید زیرا پروتئین های DNase و RNase را تجزیه کند.

جواب این سوال واقعاً ریشه در زمان بندی و بهینه سازی دارد. برخی از محققان پیشنهاد می کنند RNase را در ابتدا اضافه کنید و به کار خود فرصت دهید.  سپس پروتئیناز K و SDS می توانند برای تجزیه پروتئین های ناخواسته اضافه شوند. نکته دیگری که باید در نظر داشته باشید این است که برخی پروتوکل ها از شما می خواهند که برای مدت معینی SDS ، پروتئیناز K و RNase را در دمای 37 درجه سانتیگراد اانکوبه کنید. از آنجایی که این دما برای کار پروتئیناز K بهینه نیست احتمالا در این دما به RNase فرصت داده می شود که کار کند. مراحل بعدی زمان انکوباسیون دوم را پیشنهاد می دهد که 55 درجه سانگراد است . زمان بیشتر که بسیار برای پروتئیناز K بهینه شده است ، اجازه می دهد دیگر پروتئین های ناخواسته حذف شوند.

8- چرا دانستن عمل پروتئیناز K مهم است؟

ما در واقع یک مقاله کامل را برای توضیح بیشتر در مورد فعالیت و غلظت پروتئیناز K اختصاص داده ایم.  سناریویی که ارائه دادیم شرایطی است که یک محقق از پروتوکل قدیمی با  1 میکرولیتر پروتئیناز K استفاده می کند.  در حالی که پروتوکل آن از حجم می گوید و ممکن است کابر نیاز به میزان بیشتر یا کمتر از آنزیم داشته باشد.. در پایان ، مقاله به مهمترین اطلاعات در مورد فعالیت آنزیم ، فعالیت خاص و راههای دیگر برای ارزیابی پروتئیناز K اشاره می کند.

9- کاربردهای پروتئیناز K چه مواردی هستند؟

پروتئیناز K ، یک پروتئیناز سرین وسیع الطیف است که تحت کلاس مشابه – سوبتیلیسین قرار دارد (دو نوع پروتئیناز سرین وجود دارد ، مشابه- کیموتریپسین و مشابه – سوبتیلیسین)  به عنوان یک پروتئاز با وسیع الطیف، در درجه اول برای جداسازی اسیدهای نوکلئیک مورد استفاده قرار می گیرد، DNA ژنومی ، RNA سیتوپلاسمی ، DNA بسیار بومی ، RNA و غیره. برای این کاربردها ایده آل است زیرا پروتئیناز K قادر به تجزیه پروتئین ها و غیرفعال کردن Dnasesو  RNases است. که اگر نباشد نمونه مورد نظر که می تواند DNA  یا RNA باشد تخریب می شود. برای ساده تر کردن این موضوع از این آنزیم در موارد ذیل استفاده می شود:

  •  هضم پروتئین های ناخواسته در کاربردهای بیولوژی مولکولی
    • از بین بردن اندوتوکسین های وابسته به پروتئین های کاتیونی مانند لیزوزیم و RNaseA
    • حذف نوکلئازها برای هیبریداسیون درجا (insitu hybridization)
    • تحقیقات پریون مانند TSE (انسفالوپاتی اسفنجی قابل انتقال)
    • رد پای پروتئین
    • جداسازی میتوکندری
    • جداسازی DNA ژنومی
    • جداسازی RNA سیتوپلاسمی
    • جداسازی DNA یا RNA بسیار بومی

پروتئیناز کا

ادامه مقاله 20 سوال در مورد پروتئیناز k را می خوانید…

 

10- نگهداری پروتئیناز K چگونه است؟ دمای نگهداری آن چند درجه است؟

محلول استوک: محلول استوک خودتان را الیکوت کنید و در 20- درجه سانتیگراد برای مدت بیش از یک سال نگهداری کنید.

پودر لیوفیلیزه شده: در 20- درجه سانتیگراد و برای مدت بیش از 2 سال نگهداری کنید.

 

11- چگونه محلول استوک تهیه کنیم؟

از پزوتوکل ما  برای درست کردن محلول 20mg/ml استفاده نمایید. در این پروتوکل از بافر Tris و CaCl2 استفاده می شود.

 

12- با یک گرم پودر پروتئیناز K چه میزان محلول می توان تهیه کرد؟

در محلول 20mg/ml ، محلول معادل است با:

اندازه بسته بندی معادل به صورت محلول  (20mg/ml)
100mg 5ml
500mg 25ml
1g 50ml

 

این جدول بر اساس فعالیت س30u/mg  و600AU/ml در یک محلول 20mg/ml است.

13- پروتئیناز K در چه چیزی حل می شود/ پروتئیناز K را چگونه حل کنیم؟

پروتئیناز K شدیدامحلول درآب است و همچنین می توان آن را در Tris و PBS حل کرد.

هنگامی که با PBS کار می کنید، کمی باید مراقب باشید، بخاطر pH (که در میزان بهینه باشد) . اضافه کردن پروتئیناز K به میزان کم در هنگام محلول شدن می تواند کمک کننده باشد.

14- چگونه نوکلئاز ها را بوسیله پروتئیناز K غیر فعال کنم؟

پروتئیناز K با فعالیتی که در مقابل پروتئینهای هضم کننده دارد می تواند از نمونه DNA محافظت کند. از این پروتوکل استفاده کنید تا بوسیله پروتئیناز K بتوانید نوکلئازها را در هنگام استخراج DNA غیر فعال کنید.

15- آیا جایگزینی بغیر از پروتئیناز K در هنگام استخراج DNA وجود دارد؟

مزیت استفاده از پروتئیناز K این است که این آنزیم می تواند طیف وسیعی از انواع نوکلئازهای آسیب دهنده را غیرفعال کند. همچنین گزینه بسیار مناسبی برای هضم پروتئین های غشای بیرونی سلول است. به هر حال اگر از مواد دیگری برای این کار می خواهید استفاده کنید استخراج توسط فنول – کلوروفرم می تواند گزینه دیگری باشد تا پروتئین ها از محلول حذف شوند. البته این روش بسیار سمی تر می باشد.

 

16- پروتئناز K چه کاری می تواند برای بیماری پریون یا TSE انجام دهد؟

پروتئیناز K در تشخیص بین PrP c ( پروتئین پریون / پروتئین مقاوم به پروتئاز) و PrP sc (ایزوفرم عامل بیماری) استفاده می شود. هر دو پروتئین ها دارای وزن مولکولی یکسانی هستند. به هر حال PrP sc به پروتئیناز K مقاوم است. نمونه هایی که دارای هر دو پروتئین هستند بوسیله پروتئیناز K تیمار می شوند و PrP c از بین می رود و PrP sc تبدیل به PrP RES می شود. که دارای وزن مولکولی کمتر بوده و ته نشین می شود و بنابراین تشخیص داده می شود.

 

17- وزن مولکولی پروتئیناز K چقدر است؟

وزن مولکولی آن 28.5 کیلو دالتون است.

18- pH مناسب پروتئیناز K چند است؟

پروتئیناز K در pH بین 7.5 و 12 فعال است.

 

19- توالی اولیه پروتئیناز K چیست؟

GAAQTNAPWGLARISSTSPGTSTYYYDESAGQGSCVYVIDTGIEASHPEF

EGRAQMVKTYYYSSRDGNGHGTHCAGTVGSRTYGVAKKTQLFGVKVLDDN

GSGQYSTIIAGMDFVASDKNNRNCPKGVVASLSLGGGYSSSVNSAAARLQ

SSGVMVAVAAGNNNADARNYSPASEPSVCTVGASDRYDRRSSFSNYGSVL

DIFGPGTSILSTWIGGSTRSISGTSMATPHVAGLAAYLMTLGKTTAASAC

RYIADTANKGDLSNIPFGTVNLLAYNNYQA

 

20- پروتئیناز K چیست؟

ما تصمیم گرفتیم که این پرسش را در آخر قرار دهیم چرا که جواب آن به سادگی در وبسایت ما قابل مشاهده است.

پروتئیناز K یک سرین پروتئاز وسیع الطیف بوده که از خانواده سوبتیلیسین است. این آنزیم یک محصول شناخته شده برای تحقیقات است به دلیل توانایی آن برای غیر فعال سازی RNase و DNase هایی که به نمونه های اسید نوکلئیک در طی فرآیند استخراج آسیب می زنند. اسم این آنزیم از تواناییش در هیدرولیز کراتین نشات می گیرد.

 

منابع:

Breyer, J., Wemheuer, W. M., Wrede, A., Graham, C., Benestad, S. L., Brenig, B., . . . Schulz-Schaeffer, W. J. (2012). Detergents modify proteinase K resistance of PrPSc in different transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). Veterinary Microbiology, 157(1-2), 23-31. doi:10.1016/j.vetmic.2011.12.008

Charette, S. J., & Cosson, P. (2004, September). Quick preparation of genomic DNA for PCR analysis. Retrieved May 06, 2016, from http://www.dictybase.org/techniques/molec_biol/qui…

Ebeling, W., Hennrich, N., Klockow, M., Metz, H., Orth, H., & Lang, H. (1974). Proteinase K from Tritirachium album Limber. Eur. J. Biochem, 47, 91-97. Retrieved May 05, 2016, from http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1432-…

Muller, A., Hinrichs, W., Wolf, W. M., & Saenger, W. (n.d.). Crystal structure of calcium-free proteinase K at 1.5-A resolution. The Journal of Biological Chemistry, 269, 23108-23111. Retrieved May 04, 2016, from http://www.jbc.org/content/269/37/23108.short

Tullis, R. H., & Rubin, H. (1980). Calcium protects DNase I from proteinase K: A new method for the removal of contaminating RNase from DNase I. Analytical Biochemistry, 107(1), 260-264. doi:10.1016/0003-2697(80)90519-9

اتمام مقاله “پاسخ به 20 سوال در مورد پروتئیناز K”

کلما مرتبط: قیمت پروتئیناز کا، پروتئیناز کا، تفاوت پروتئیناز و پروتئاز، پروتئیناز چیست